错配固相化学切割法实验（二）
(二）方法
1. 均一标记探针的制备
（1）取一无菌离心管置于冰上，加入如下组分。
基因组DNA 50~100ng
引物5A 20pmol
引物5B 20pmol
dNTP溶液（10mmol/L)2.5ul
[a-32P]dCTP(25uCi/ul)2ul
Taq聚合酶（1U/ul) 1ul
PCR缓冲液（10X) 10ul
H20 至100/ul
（2）按下面程序扩增。
（3）用 20 g/L的琼脂糖凝胶分离产物。切下目标条带，按操作手册用Qiaquickspincolumns纯化DNA。
（4）用无菌水稀释探针至10000cpm/ul。
如果DNA 片段未能有效地标记上，则不加同位素重新扩增. 如果凝胶显示反应产物条带较好，则加入同位素，用 2ul产物作为模板重复扩增。
2. 固相化学切割：形成异源分子
（5）在无菌离心管中按下面步骤进行退火反应。
探针DNA(10000cpm/ul) 5ul
待测DNA 5ul
退火缓冲液，2X 10ul
100°C 保温 5 min，42°Clh。
（6）短暂离心收集样品，加入 20u1磁珠（按操作手册预洗）到每个退火反应中。
（7）室温下轻摇（使磁珠保持悬浮）15?30 min，时间取决于 DNA 片段的大小。
（8）将管放置到磁力架上 30s。保持离心管在架子上，移去上清液。用Geiger计数器检测沉淀以确保大部分放射标记仍吸附在磁珠上。上清液中也可能有一小部分未结合的放射性DNA片段。
（9）移去离心管，用 1体积的2XB&W 缓冲液洗一次。
（10）将管放到磁力架上，移去B&W 缓冲液。
（11）用26ulH20悬浮磁珠。
3. 化学切割反应
（12）每步退火反应产物均分到4 个新管中，每管6ul;2管用羟胺处理，另外2管用四氧化锇处理。
当分析一条片段时，第一次（样品通常会分析几次）推荐将退火反应产物分到4个管中，2管用羟胺处理，另外2管用四氧化锇处理。样品f要用化学药品处理不同时间（见(13)和(14) 步）。处理时间受突变类型和DNA片段大小的彩响，特别是四氧化锇还有修饰错配胸脒嘧啶外碱基的特性，所以一旦反应最适的保溫时间确定下来后，毎次化学处理就可以使用单个样品。
（13）向2个羟胺反应管中分别加入20ul 羟胺溶液，37°C下一管保温10 min，另一管保温 30 min。
（14）向每个四氧化锇反应管中分别加入2.5ul四氧化锇缓冲液和15ul四氧化锇溶液（在H20中1:5),37°C下一管保温1min, 另一管保温 5 min。
（15）将管子放到磁力架上 30s，保持管子在架子上，移去上清液。用Geiger计数器检测上清液，所有成分应在沉淀中。
（16）从磁力架上移走管子，用20ul2XB&W缓冲液洗磁珠。
（17）再将管子放到磁铁上，移去上清液。
（18）用 50ul10% 的哌啶溶液悬浮磁珠，90°C 保温 30 min。
哌啶切割可能使链霉抗生物素蛋白包被的磁珠与DNA分离。这些磁珠需要在步中替换。
（19）冰上反应2~3 min。
（20）向每个反应混合物中加入25ul1mol/LH3P04 和10XTaqDNA聚合酶缓冲液。
混匀后于100°C 保温5 min，缓慢冷却到30°C(约30 min)。
（21）向每个样品中加入 5ul 新的、预洗过的磁珠，室温下轻摇 15?30 min。
（22）将管子放到磁力架上30s，保持管子在架子上，移去上清液。
提示：用Geiger计数器检测放射标记的 DNA片段仍结合在磁珠上。
（23）从磁力架上移走管子，用20ul2XB&W缓冲液洗磁珠。
（24）用5ul 甲酰胺染液悬浮磁珠，90°C 保温3 min管子放到冰上预冷的磁力架上，将上清液点样到标准的聚丙烯酰胺测序胶。电泳结束后，曝光到X射线胶片上。
三、方法B: 荧光标记反应
如前所述，要准确定位突变位点，每个反应需要使用完全相同的引物对。荧光分析中要合成两套完全相同的PCR引物：在第一对引物中，两条引物都用生物素标记；而另一对引物中，每条引物用不同的荧光基团标记。简要的技术方案如图20-2所示。
这里提供的方案是利用鼠β-球蛋白启动子为分析对象进行的实验（Youiletal.1996)，引物用生物素或HEX和6-FAM标记。引物对可扩增出一条长547bp的片段（Youil etal.1996;Lambrinakosetal.1999)。
(一）附加材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)
KMn04/TEAC溶液（lmmol/LKMnO4，3mol/LTEAC)
糖原（20 mg/ml)
乙酸纳，0.6mol/L，pH5.2
乙醇, 冰上预冷
乙醇，70%
2. 核酸和寡核苷酸
两套寡核苷酸引物：5'-GCACGCGCTGGACGCGCAT
5'-AGGTGCCCTTGAGGCTGTCC
一对引物用生物素标记；另一对引物用荧光基团标记，如HEX和6-FAM。
3. 特殊设备
ABI377、310、3100或3700DNA测序仪
干冰（可选用，见（二）方法中(16)）
温育或水浴，预置65°C和100°C
(二）方法
1. 荧光标记探针和待测DNA的制备
（1）取一无菌离心管置于冰上，加入如下组分。
基因组DNA 50~100ng
引物5A* 20pmol
引物5B* 20pmol
dNTP溶液（10 mmol/L) 2.5ul
T叫聚合酶（lU/ul) 1ul
PCR缓冲液（10X) 10ul
H2O 至100ul
*第一套 PCR扩增中，用荧光标记引物扩增待测DNA(见材料列表>, 用生物素末端标记的引物扩增野生型 DNA。第二套PCR 中，交换标记引物对，也就是用生物素末端标记引物扩增待测DNA, 用荧光标记引物扩增野生型 DNA。
按下面 PCR 程序扩增。
（2）取少量 PCR 产物用2% 的琼脂糖凝肢检测。若结果令人满意，则按如下程序进行异源双链退火反应（注意：40u1 样品足够进行 KMn04和羟胺处理）。
野生型扩增子（20ng/ul) 5ul
待测扩增子（20ng/ul) 5ul
退火缓冲液，2X 20ul
H2O 至 40ul
100°C 保温5 min,42°C 保溫 lh。
（3）对照组，按如下程序进行同源双链退火反应。
野生型扩增子（生物素标记引物）（20ng/ul) 5ul
野生型扩增子（荧光标记引物）（20ng/ul ) 5ul
退火缓冲液，2X 20ul
H2O 至 40ul
100°C 保温5 min,65°C保温 80 min 缓慢冷却至室温（过夜）。短暂离心收集样品后，对照组同源双链分子的处理方法与异源双链分子处理方法相同。
（4）按操作手册预洗链霉抗生物素蛋白包被的磁珠，用 124B&W缓冲液重悬。
12ul 磁珠需要用12ulB&W缓冲液洗 3 次。
（5）每个退火反应（同源双链分子和异源双链分子）中加 6ul 磁珠悬浮液。室温轻摇15~30 min(取决于DNA片段的大小），保持磁珠悬浮。
（6）将管子放到磁力架上30s，保持管子在架子上，除去上清液。
（7）从磁力架上移走管子，用20ulTE 洗液洗磁珠。再将管子放到架子上，除去 TE洗液。
（8）每份双链样品用12ulTE 溶液重新悬浮。
（9）每份样品（同源双链分子和异源双链分子）都均分成两份，每份 6m1。
2. 化学切割
（10）取一份同源双链分子样品及一份异源双链分子样品进行 KMn04 反应，在磁力架上除去 TE 缓冲液。在这一步中，每个反应中应有约 75~100ng 结合在磁珠上的DNA,
（11）向每个反应混合物中加20ul1 mmol/LKMnO4/3mol/LTEAC，25°C保温 45 min。
（12）同时，分别向余下的另一份同源双链分子与异源双链分子样品中加入20ul羟胺溶液(4.2mol/L)，37°C保温30 min。
（13）将管子放到磁力架上停止反应，除去上清液。
（14）用50ulTE 洗磁珠 2 次。
（15）所有 4个管子中都加 50ul10% 哌啶溶液，90°C保温30 min。
（16）管子放置到冰上，加入 0.5ul 糖原（20 mg/ml)、50ul 乙酸钠（0.6mol/L，pH5.2)和 300ul 冰冷的乙酵，沉淀 DNA。-20°C 放置30~45 min 或干冰上 10min*。
（17）小离心机中 4°C 最高速离心 30 min，除去上清液。
（18）180ul70% 乙醇洗涤沉淀。
（19）小离心机中最高速离心1min, 小心除去乙醇。
（20）用1.5ul 甲酰胺染液溶解沉淀，上样到 ABI-377DNA 序列仪（PerkinElmer)，或者加12ul甲酰胺与分子量标准后，上样到毛细管电泳系统中。DNA片段可被荧光检測系统检测到。
*（16）~（19）步中沉淀 DNA 也可采用下面方法：每份样品中加入5ul新的预洗的磁珠，室溫下轻摇15~30 min。将管子放到磁力架上30s, 保持管子在架子上，移去上清液，继续笫 (20)步。
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