分级定量PCR检测血清HBV DNA
引言
PCR技术对基因从定性到定量的测定是分子生物学方法研究一大飞跃，定量PCR已成为目前分子生物学技术研究的热点之一. 迄今研究和应用的定量PCR方法有4种，即PCR产物的直接定量；极限稀释法；靶基因与参照基因的同步扩增；竞争性PCR法. 以上方法各有利弊，选择某一方法取决于靶基因的特性，对准确度的要求，需要相对还是绝对的定量. 其中竞争性PCR方法的定量比较准确，被较多地采用［1］. 但该方法在实际应用时，需将恒量的样品DNA与一系列稀释的各种浓度的竞争性模板混合后进行PCR扩增，zui后进行电泳，找出待测模板与竞争性模板终产物有相等摩尔数的一个反应，从而确定待测模板的初始量. 因此，对一个样品定量时需要进行多个反应，不适应多样品的同时定量测定. 我们建立了分级定量方法，只用3种浓度的竞争模板与恒定量样品DNA进行3个PCR反应，通过测定待测模板与竞争模板的终产物荧光强度比值，来确定待测样品DNA的初始模板量. 该方法适合多样品同时测定.
目的 利用竞争PCR法建立分级测定HBV DNA含量的定量方法.
方法 设立3个标准竞争模板（102cop, 104 cop, 106cop），分别和恒量的待测模板混合，分别进行40，30，20次循环的PCR扩增，zui后凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的PCR产物，测定两者的荧光强度的比值，计算待测模板的初始量.
结果 对乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg阳性血清，HBV DNA的血清浓度在6×107～1×1011cop/L，而12份HBeAb阳性血清只有7份可检出HBV DNA，它们的血清浓度均在3×108cop/L以下，其余5份用该PCR方法，检测不到.
结论 该方法可用于HBV DNA以及其他病原体DNA的定量.
1 材料和方法
1.1 材料 GQS-960凝胶成像分析系统（第四军医大学基因诊断技术应用研究所），Thermolyne PCR扩增仪（美国）,Taq DNA聚合酶，dNTP （Promega公司）. 引物出自HBV DNA的X区，经oligo软件设计. 引物位置和序列为：B1（1402-1421），5,-ATC CTGCGCGGGACGTCCTT3；B2（1626-1607）5,-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3扩增比较为225bp，由上海深工生物工程公司合成.
1.2 方法 含靶序列的PUC 19质粒和竞争序列的PUC19质粒，将B1，B2引物扩增HBV DNA的产物克隆入PUC19，该质粒作模拟靶序列用；竞争模板是在正常的B1，B2引物扩增产物中央部插入一段人工合成的40bp的DNA片段，并克隆于PUC19，该质粒作定量实验的竞争模板. 血清处理，主要按酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法［2］提取血清中HBV DNA，血清用量为300μL，zui后所得HBV DNA等分3份作定量PCR扩增. PCR扩增取上述纯化的HBV DNA（各5μL）分别加入三个定量反应管中，其中的竞争模板量分别为102cop,104cop,106cop. PCR反应成分为50mmol/L KCl，100mmol/LTris-HCl pH 8.3，1.5mmol/L MgCl2， 200μmol/L dNTP，B1，B2引物各30pmol. Taq DNA聚合酶1U，反应总体积30μL. 反应程序为：94℃预变性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s, 72℃ 50s分别循环40次，30次，20次后，72℃延伸5min，zui后各准确取10μL PCR反应产物，进行40g/L琼脂糖凝胶电泳［3］. 荧光强度测定：将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶呈像分析系统上进行扫描，测定荧光强度比值［4，5］，并用微机计算结果.
2 结果
2.1 竞争模板与待测模板扩增效率比较 对3个待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度比分别为10∶1；1∶1；1∶10的反应液进行106倍稀释，再各取3μL稀释后溶液进行PCR扩增，循环30次，结果两者荧光强度之比仍为10∶1；1∶1；1∶10. 说明所用引物对待测模板与竞争模板的扩增效率相等.
2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 将提取并纯化的含有两种模板的两种质粒定量后，按2×105，2×104，2×103，2×102，20 cop分别进行PCR扩增反应，扩增40次循环，结果两种模板都被检测到20 cop的模板量.
2.3 标准曲线
2.3.1 标准曲线1 将102 cop的竞争模板分别与20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，2000，4000 cop的待测模板（含靶序列的PUC19质粒）混合后进行40次PCR扩增. 测定待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度之比（Ax/Ao），并以1g（Ax/Ao）作纵坐标，以待测模板初始量的对数lgX为横坐标作标准曲线1（以下作法相同）.
2.3.2 标准曲线2 将104 cop的竞争模板分别1×103，2×103，4×103，6×103，8×103，1×104，2×104，4×104，6×104，8×104，1×105，2×105，4×105 cop待测模板混合后，分别进行30次PCR扩增，作标准曲线2.
2.3.3 标准曲线3 将106 cop的竞争模板分别1×105，2×105，4×105，6×105，8×105，1×106，2×106，4×106，6×106，8×106，1×107，2×107，4×107 cop的待测模板混合后，分别进行20次PCR扩增，作标准曲线3.
2.4 临床样品的检测结果 用该定量法对24份HBV感染者的血清进行定量测定，其中12份HBeAg 阳性的血清PCR检测HBV DNA为阳性，HBV DNA在血清中的含量6×107～1×1011/L之间（8×109，6×107，5×1010，4×108，10×1010，5×108，1×1011，7×108，9×108，7×1010,4×109,5×109 cop/L），平均在2.1×1010/L. 而12份HBeAb阳性血清进行测定时，其中7例血清PCR可检出HBV DNA阳性，HBV DNA在血清中的浓度在2×105～3×108 cop/L（6×106，4×106，2×105，5×105，3×108，7×105，1×106 cop/L）. 而其余7份血清PCR检测HBV DNA为阴性.
3 讨论
用竞争性PCR定量的基本条件是靶序列和竞争性序列用相同的引物，并以相同的效率扩增［1］. 在本实验中，我们采用一对引物对待测靶序列和竞争序列同时扩增，竞争序列是在靶序列中央插入40bp人工合成的DNA片段而来的，这样就保证了靶序列与竞争序列有相似性，使扩增效率相接近. 实验证明，我们设计的竞争模板与待测靶序列有相同的扩增效率，即两者开始的比值经扩增后没有改变，这就保证了本定量实验的可行性. 插入40bp序列也足以使扩增后的两种产物能在琼脂糖凝胶上被分离开. 但这段序列又不能太长，以免扩增效率和待测模板不一致. 在实验中为了使两条扩增带不相干扰，PCR扩增一定要保证特异性扩增. 为此该定量方法要求按严格的标本处理方法提模板DNA，同时对不同浓度范围内的模板按不同的循环次数扩增，即20～103 cop/每管的PCR用40次循环扩增；103～105cop/每管的PCR用30次循环扩增，105～107cop/每管的PCR用20次循环，这样不仅可以保证低浓度模板能被扩增出来，同时高浓度模板经扩增不易出现非特异扩增带，这样就有了定量的前提条件.
该方法的理论基础为Ax/Ao=（225Yx）/（265Y0）=［225X（1+e）N］/［265M0（1+e）N］. Ax/Ao为待测模板与竞争模板的扩增产物带荧光强度比；Yx/Yo为待测与竞争模板扩增产物拷贝数之比；225bp为待测模板的长度；265bp为竞争模板的长度；X为待测模板的初始量；Mo为竞争模板初始量；e为扩增效率；n为循环次数. 由于本实验中两种模板扩增效率相同，循环次数相同，上式就变为Ax/Ao=225X/265Mo，取对数后为1g（Ax/Ao）=lgX+1g（225/265Mo）. 因此，1gX与1g（Ax/Ao）成线性关系［6］. 但在作分级定量的3个标准曲线时，当靶序列比竞争序列的拷贝数大于10倍以后，标准曲线就渐渐偏离理论值，斜率逐渐增大. 这是由于当待测序列的初始模板量大于竞争序列10倍以上时，经过一定的扩增循环后，待测序列的扩增产物量急剧增大，这些产物所产生的荧光强度已接近或超过了检测系统的饱和限. 因此Ax值增加幅度很微小，直至饱和，此后Ax的测量值不再变化［7］. 而另一方面由于PCR反应体系中各种成分迅速被大量的待测序列及其产物占有，竞争序列的扩增就受到强烈地限制，zui终扩增产物下降到A0值接近0. 因此我们看到随着待测序列分子数量增加，标准曲线将迅速上升. 为此我们每一级的定量范围在标准竞争模板量的10±1之间.
在定量测定时，我们采用GQS-960凝胶成像及分析系统，对待测及竞争模板的扩增带进行荧光强度比较，经微机计算出相应的待测模板拷贝数. 该方法仍采用溴化乙锭染色，紫外灯下测定荧光. 因此过去有定性PCR设备的实验室，只需购买一套凝胶荧光强度检测仪就可以开展工作. 该定量法不需象以往竞争PCR定量方法那样，测定一个样品DNA要有一系列稀释的竞争模板来标定，而是只要作3个定量（与102，104，106cop竞争模板混合）反应就可zui终定出待测DNA模板的拷贝数. 用该方法分别对12份HBeAg阳性和12份HBeAb阳性血清进行定量分析，结果前12份血清均可检测到HBV DNA，并且血清浓度为6×107～1×1011cop/L. 而后12份只检出7份HBV DNA阳性，其在血清中的含量在2×105～3×108 cop/L之间，还有5份血清用该PCR方法未检出HBV DNA. 以上定量结果与文献报道的相近［3］. 上述结果也说明了为什么用简便的处理血清方法进行PCR扩增时，HBeAb阳性血清大部分往往检测不到HBV DNA的原因. 因为一般抗HBeAb阳性血清中HBV DNA含量较低（在3×108 cop/L以下），而简便血清处理方法zui多只取相当于2μL血清中的HBV DNA作PCR扩增，按上面结果计算只含有0.4～6×102 cop. 因此就有一大部分不能被检测出来.
总之，该方法操作简便，结果准确，可用于临床定量检测各种病原体的DNA.
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