原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)与荧光原位杂交（三）
（1）DAN斑点杂交
①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品一般点50μl（2～10μg DNA）。
④将膜烘干，密封保存备用。
（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。方法是将RNA溶于5μlDEPC水，加
15μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛）使RNA变性。然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。
培养细胞，标本处理技术可以简化，不用提取和纯化RNA。方法是用含0.5%Nonidet
P40的低渗缓冲液对多种动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带DNA而富含RNA的细胞质提取物，这一粗RNA在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5×104）或组织。
整个RNA实验中，要防止激活内源性RNase，有许多种预防措施，有一种是在样品中加入核糖核苷氧矾基复合物（RVC）。
（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测。将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到少至5pg
的Epstein –
Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它是使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P
标记的探针杂交。但它不适于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。
3．Southern印迹杂交（southern blot ） Southern blot
是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1）琼脂糖凝胶电泳：利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消化片段（0.3～25kb）分离开。分离大分子DNA片段（800～12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%）,300～5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶，根据分离样品量、分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。
电泳时，同时将标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜。电泳毕，将胶浸到含0.5μg/ml
EB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在配胶前加入胶中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5,曝光20～40s。
