浅谈原代细胞培养那些事（二）
四、原代细胞培养流程（例：乳鼠肺组织）
1.取材：将1-3天新生乳鼠尾巴提起，整个身体浸入装有75%酒精的烧杯中3秒左右（默数5下），取出放置到灭菌的培养皿中，移入工作台内。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大头针分别固定头、尾和四肢。用碘酒、75%酒精消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处，用两把眼科弯镊夹起皮肤（多夹些），向左右两侧撕拉，膈肌部位皮肤向尾端拉，皮肤外翻固定，躯干部肌肉暴露（注意：不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，沿着隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓暴露后，可见跳动的心脏和粉红色的肺。将眼科镊弯头端向下，从心脏右上方位插入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一起取出，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks也的青霉素瓶内。
2.漂洗：用Hanks液漂洗肺脏表面血污，然后粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次后，吸去多余液体。
3.剪切：组织小块置青霉素瓶一角，用眼科直剪反复剪切组织块成1立方毫米大小，此过程需20~30分钟。
4.消化：消化条件的选择和组织块大小、组织的硬度、消化酶浓度和种类、实验温度、pH值等有关。消化酶浓度范围为0.25%~0.5%，pH为7.4~8.0，所使用消化液量是被消化物的5~10倍。可通过预实验，确定jia消化条件。
5.制备单细胞悬液
•离心管的外壁和管口处经酒精消毒，然后移入超净台内，管口火焰消毒，Hanks液加至10ml(稀释酶浓度，停止消化）
•用吸管头反复轻轻吹打松散组织，当其能顺利地通过吸管口时，消化较合适，悬液中有较多分散的单细胞和小细胞团。
•离心管直立静置片刻，少量未消化的组织块自然沉降（可加消化液再消化）。将细胞混悬液移至离心管中，补加Hanks液至10ml，混匀后离心（速度、时间同上）。
科研中常用筛网法去除细胞混悬液中的细胞团，收集过筛网的单细胞悬液。
•去上清液后加2ml细胞培养液，细胞混匀计数，调整细胞浓度为5.0×105/ml。
6.接种：在培养瓶的侧面做好标记，培养物的名称、组号和日期。接种时，在25ml培养瓶中先加入1.5ml培养液，再接种1ml细胞悬液，用吸管轻轻混匀细胞后加盖瓶塞。持瓶作上下、左右十字形水平晃动后，移入37℃、5%CO2培养箱中培养。
五、原代细胞操作要领
1.原代细胞混匀操作要领
•火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。
•吸管头插入管底。
•用吸管反复轻轻吹打组织块。
2.器械的使用操作要领
•用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械
•器械置无菌干纱布内擦一下，迅速通过火焰，冷却后使用
•用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒
•器械按浸泡消毒的顺序使用
•各套再消毒器械不可混用
3.除去组织块多余水分的操作要领
用吸管将组织块推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。
注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。
4.细胞计数操作要领
•用吸管混匀待计数的细胞悬液
•将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交接部位滴入细胞计数池中
•沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为1
•计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。
（四大中格细胞数/4）×10000=细胞数/毫升
注：细胞计数板上，每一中格体积为0.1立方毫米
六、原代培养注意事项
•细胞生长密度不高时，不能急于传代培养
•原代培养的贴壁细胞需控制消化时间
•吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形
成，以尽可能减少对细胞的机械损伤
•*传代细胞接种数量应多一点，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬
液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。
•*传代细胞培养pH偏低些
•胎牛血清浓度可加大至15%-20%
•加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来
七、如何提高原代细胞培养的成功率？
•在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。在处理胚胎的时候要干净利落。不要把胳膊等部位的细胞混进去了。
•操作一定要无菌，不能污染。在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一点。
•运用消化法时胰酶温度应小于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。
•如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。
•取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
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