离子交换柱层析条件的选择
对于分离一个特定的蛋白质，选择什么样的柱子、离子交换剂和流动相等需根据具体情况统筹考虑，主要是根据待分离蛋白质本身的理化性质和生物学性质确定。因此，在采用离子交换层析法进行蛋白质的分离之前，应当对待分离的蛋白质的性质有所了解，如等电点、相对分子质量、疏水性、生物活性及测定方法、溶解性、浓度、发生聚合的可能性、稳定性以及微观不均一性等。由于多数情况下离子交换柱层析采用梯度洗脱，因而柱子都不需很长。了解样品的等电点决定选用阳离子还是阴离子交换剂以及流动相的pH；样品的相对分子质量Mr将决定选用多大孔径的柱填料；疏水性强的样品则要求选用疏水吸附较小或亲水性载体的交换剂，以防止非特异性疏水吸附；活性测定方法可用来鉴定分离到的样品及测定回收率；样品的溶解性在选用流动相的种类时是必须考虑的，并依此决定是否要在流动相中添加促溶剂；根据样品的稳定性决定层析温度、流动相pH以及是否要在流动相中添加稳定剂；样品的浓度和含量是选择柱体积大小和每次进样量的依据；对于那些存在微观不均一的样品，由于它们在结构和性质上极其相似，所以在分离时要采用分辨率尽可能高的条件(如等梯度洗脱)；对某些样品还要选用适当的样品浓度、pH和盐浓度以防止其发生聚合。
(1)离子交换剂的选择在等电点已知的前提下，若所用缓冲液的pH高于等电点，则用阴离子交换剂；反之，若所用缓冲液的pH低于等电点，则用阳离子交换剂；若先确定了所用离子交换剂的类型，那么，就必须对缓冲液的pH作相应的调整。但在实际应用中，为了避免样品处于过酸或过碱的环境，对于酸性蛋白质和多肽样品(pI<6)，通常是使其带有负电荷而采用阴离子交换剂；对于碱性蛋白质和多肽样品(pi>8)，通常是使其带有正电荷而采用阳离子交换剂。等电点未知时，可参照电泳分析的结果。在中性和偏碱性条件下电泳时向阳极移动较快的物质，同样条件下可被阴离子交换剂吸附；向阴极移动或向阳极移动较慢的物质，同样条件下可被阳离子交换剂吸附。但有时有例外，因为某一物质的层析行为，除与分子的净电荷有关外，还与它的分子大小、分子结构和电荷排列等有关。对于等电点未知的蛋白质，还可用阴离子交换剂和阳离子交换剂分别在较高pH(如pH8.6)和较低pH(如pH5.5)条件下进行离子交换实验，观察交换吸附的情况。如果待分离的物质能被两种交换剂吸附，则两种离子交换剂都可用于分离，而且待分离物质与其他成分分离的机会更多。如果都不吸附，则尽量降低样品和起始缓冲液的盐浓度，直至几乎为零。若发现被吸附的物质由于吸附太牢而不易洗脱，则应选用交换当量较小或具有弱解离活性基团的离子交换剂。
(2)缓冲液的选择缓冲液离子应不影响被分离物质的活性并不干扰其测定，不影响样品的溶解度和稳定性。如洗脱液要用280nm波长检测时，缓冲液内就不能有芳香族化合物；如要用215～225nm波长检测肽键的含量，则不能用含羧基的缓冲液。采用阳离子交换剂时，应选用阴离子型缓冲液，如磷酸、醋酸缓冲液等。采用阴离子交换剂时，应选用阳离子型缓冲液，如Tris、吡啶缓冲液等。
缓冲液pH的确定首先取决于被分离物质的等电点，采用阳离子交换剂时应低于物质的等电点，采用阴离子交换剂时应高于物质的等电点。同时要结合考虑被分离物质的溶解度、稳定性和离子交换剂的活性基团的PK´。用阴离子交换剂时pH应低于其pK´，用阳离子交换剂时pH应高于其pK´，且应使缓冲液pH介于样品等电点和pK´之间。
为了降低盐离子的竞争，起始缓冲液的浓度要尽可能的低(如0.01mol/L左右)。这就需要选用其pK´接近所需pH的缓冲离子，以使缓冲液具有较强的缓冲能力，避免缓冲离子与离子交换剂作用而引起pH的改变。当确信样品易被吸附后，可适当提高起始缓冲液的浓度以保证一定的缓冲能力。
