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TUNEL分析实验——组织切片的 TUNEL 染色

2019.4.04

实验材料	组织
试剂、试剂盒	甲醛 NaOH PBS 二甲苯乙醇蛋白酶 K Tris-HCl 溶液
仪器、耗材	Parafilm 膜
实验步骤	1. 取下组织，立即用新制备的 4% 甲醛固定，室温过夜。用多聚甲醛制备 4% 的甲醛溶液，在 100 ml 水中加 8 g 多聚甲醛，在通风橱中加热至 50~60℃，加几滴 1 mol/L NaOH 使固体全部溶解。多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。加 100 ml pH 7.2 的 2X PBS，过滤固定液。甲醛储存液应在每次实验前新配。 2. 通过 50%、70%、80%、95%、100% 乙醇和 100% 二甲苯系列孵育使组织脱水。 3. 用石蜡包埋组织，制备 5 μm 厚的切片，固定于玻片上。将石蜡切片 70℃ 加热 10 分钟或 58~60℃ 加热 30 分钟去除石蜡。 4. 通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯 5 分钟 2 次，96% 乙醇 3 分钟 2 次，然后 90%、80%、70%、50%，双蒸水各 3 分钟。 5. 在冷的 4% 甲醛中后续固定切片 5 分钟，用 pH 7.2 的 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。 6. 室温下用 1~2 μg/ml 蛋白酶 K 的 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0）处理玻片 10 分钟，用 PBS 清洗 3 次。 7. 用 0.5% H₂O₂ 的 PBS 溶液室温处理 20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。 8. 用补充有 150 mmol/L NaCl 和 0.05% BSA 的 TdT 反应缓冲液预孵育切片。每个切片上加 27 μl 溶液，用已裁成合适大小的 Parafilm 膜覆盖。 9. 室温孵育 10 分钟后，取下 Parafilm 膜，用纸巾吸去水。 10. 在用 TdT 反应缓冲液制备的 200 U/ml TdT 酶、2~4 μmol/L 地高辛配基偶联的 dUTP 中孵育切片，再用 Parafilm 膜覆盖切片，37℃ 温室中 30 分钟~1 小时。用 pH 7.2 的 PBS 将切片洗 3 次。 11. 用 5 U/ml 辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛孵育玻片，用 Parafilm 膜覆盖。37℃ 温室中孵育 30 分钟。 12. 应用快速 DAB 底物，用 DAB 和 H₂O₂ 处理检测标记细胞，用过量水清洗切片。可用甲基绿复染切片 30 秒。用过量水清洗。 13. 通过用二甲苯终洗 2 次的系列乙醇使切片脱水。展开