tunel法荧光和显色法原理的区别
TUNEL法检测细胞凋亡操作步骤
操作步骤
1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；
3.PBS漂洗2次；
4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；
5.PBS漂洗2次；
6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。
8.PBS漂洗3次；
9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）；
10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11.PBS漂洗3次；
12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；
13.PBS漂洗3次；
14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。
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