INS-1细胞培养
实验概要
INS-1细胞培养
实验步骤
所需要的各种溶液
1.培养基（4℃保存，使用前在37℃水浴中温育）
1) RPMI 1640 with Glucose(11mM)
90ml
2) Fetal Bovine Serum (灭活)
10ml
3) Sodium Pyruvate(100mM,使细胞增加内源性CO2的产生)
＋1ml
4) β-Mercaptoethanol(自由基的清除剂)
0.1ml
=101.1ml
2.Poly-L-Lydine:0.1mg/ml（4℃保存，）
3.Trypsin-EDTA（胰酶）（－20℃保存，使用前在室温自然溶解）
Contains 0.5 g/L of trypsin (1:250) and 0.2 g/L of EDTA•4Na in Hanks' Balanced Salt Solution without CaCl2, MgCl2 • 6H2O, and MgSO4 • 7H2O. Contains phenol red.
4.磷酸缓冲盐溶液（PBS）（4℃保存，使用前在37℃水浴中温育）
137mmol/L NaCl (8g)
2.7mmol/L KCl (0.2g)
10mmol/L Na2HPO4 (1.44g)
2mmol/L KH2PO4 (0.24g)
在1L三蒸水中加入四种成分，调pH 7.4, 渗透压 300mOsm.
FBS灭活：
无菌的PBS分装前，56°温浴 30min，灭活。然后分装。
细胞滴片传代
1. 准备超净工作台，将试剂及材料置于超净台上，开始实验。
2. 仔细检查培养物有无污染或衰退迹象。
3. 依照传代标准（70％－90%的密度）决定是否对细胞进行传代。
4. 在酒精灯下烘干小玻片（每个小培养皿1个玻片），涂上.Poly-L-Lydine,5分钟后吸干，用无菌水洗一遍，在超净台内自然晾干。
5. 将培养细胞置于无菌工作区域，弃去旧培养基。
6. 为了避免冲散细胞，沿培养瓶细胞面对侧加入PBS(对应相应培养基的体积)，清洗细胞，去除清洗的PBS。这一步的主要目的使去除残留血清，因为血清可抑制胰酶的作用。洗两遍。
7. 加入胰酶于12孔板中（0.1ml/孔），缓慢摇晃确保胰酶完全覆盖细胞层。室温或37度下消化细胞。
加入胰酶于培养瓶中（1ml/孔），缓慢摇晃确保胰酶完全覆盖细胞层。37℃下静置于培养箱中1.5min-2min。可以拍打细胞生长面观察胰酶的消化效果，只要有细胞脱落即可终止消化。
8．加入培养基终止消化，用枪头或移液管反复吹打单层培养细胞面以分散细胞成单细胞，注意尽量不要产生气泡。（INS-1细胞比较脆弱，对于6孔板的细胞缓慢吹打10－20次，对于培养瓶缓慢吹打20－30次即可，主要根据单细胞的百分比确定吹打的终止，一般对于70％－90％的单细胞百分比即可终止吹打）
9．根据细胞的密度估计相应的体积的细胞到小玻片上，在37℃培养箱中静置10-20min，加入2ml培养液。20－72 h之后即可进行实验
Poly-L-Lydine:先配成1mg/ml的母液，用时1：7或1：9稀释即可。（0.1mg/ml）
G418:100mg/ml, 100ml INS1培养基中加入400ulG418抗生素。
Cell Cultures
INS-1 cells (27) (a gift from C. Wollheim, Geneva, Switzerland) were routinely grown at 5% CO2-95% air at 37 C in RPMI-1640 containing 11.1 mM glucose and supplemented with 10% FBS, 1 mM pyruvate, 10 mM HEPES, 50 M 2-mercaptoethanol, 100 U penicillin/ml, and 100 g streptomycin/ml. In all the experiments described the RPMI-1640medium contained the supplements described above. Cells were passaged weekly after trypsin-EDTA detachment. All studies were performed on INS-1 passages between 70 and 84.
