凝胶过滤(gel filtration,GF)实验方法
1. 凝胶的选择
根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶,如除盐和除游离的荧光素,则可选用粗、中粒度的G25或G50,G250多用于分离蛋白质单体,G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2. 凝胶的预处理
称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀,或在沸水中煮,膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格 | 凝胶的规格和用量(g) | |||||
直径(cm) | 高(cm) | 容量(ml) | G25 | G50 | G100 | G200 |
0.9 | 15 | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 | 0.3 |
0.9 | 30 | 19 | 5 | 2 | 1.2 | 0.6 |
0.9 | 60 | 38 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 20 | 40 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 40 | 80 | 20 | 8 | 5.0 | 2.4 |
1.6 | 70 | 140 | 35 | 14 | 9.0 | 4.4 |
1.6 | 100 | 200 | 50 | 20 | 12.5 | 6 |
2.6 | 40 | 210 | 50 | 20 | 12 | 7 |
2.6 | 70 | 370 | 90 | 35 | 20 | 12 |
2.6 | 100 | 530 | 130 | 50 | 30 | 17 |
2.6 | 60 | 1000 | 250 | 110 | 70 | 35 |
为使粒子均匀一致需进行浮选,即加入凝胶粒子后,轻轻搅拌,静置20min,倾去沉淀的粒子,如此反复数次即可。
3. 装柱
层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4~10
倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1:5~1:25;对于纯化蛋白质来说应为1:20~1:100。
4. 加样与洗脱
样品体积不宜过多,最好为床体积的1%~5%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用
0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L
pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14Mol/L NaCl)。
5. 洗脱液收集
利用自动分步收集器收集,并以20%磺基水杨酸测试,当蛋白液下来时,开始分管收集,至无蛋白液为止。 6. 凝胶柱的重复使用与保存
当样品的各组分全部洗脱下来之后,即可加入新的样品,继续使用。保存方法有三种:
(1) 在液相中保存最方便,即于凝胶悬液中加入防腐剂(如0.002%洗必泰)或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
(2) 用完后,以水冲洗,然后用60%~70%酒精液冲洗,凝胶体积缩小,即在半收缩状态下保存。
(3) 长期不用者,最好以干燥状态保存,即水洗净后,用含乙醇的水洗,逐渐加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽滤干,于 60℃~80℃干燥后保存。加乙醇时,切忌一上来就用浓乙醇处理,以防结块。