蛋白质凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析（也叫分子筛）是利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行分离的技术。
凝胶过滤层析（GF）法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤层析非常适合对pH变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子。
为了进行分离，将凝胶填料装柱形成柱床。填料是球状颗粒的多孔填料，根据其化学和物理稳定性以及惰性（没有反应性和吸附性）进行的选择。在分离过程中，样品用同溶剂进行洗脱，而在分离的后期，通常需要使用流动的缓冲液，以便移除柱子中残余的分子，使柱子可用于下一次分离。
样品制备：
1.样品必须澄清，没有颗粒状物，否则容易堵塞层析柱。
2.样品缓冲液：样品缓冲液的pH、离子强度和组成不会显著性影响结果的分辨率，只要这些参数不影响被分离蛋白质的大小和稳定性，也不超出填料的稳定范围。
3.样品浓度：凝胶过滤分离效果与样品量无关，因此与样品浓度也没有关系。通常蛋白浓度不要超过60mg/mL。样品的溶解性和粘度会限制样品浓度，关键在于样品相对于流动相的粘度，太高的样品粘度会引起分离的不稳定性和不规则的流动形式，会导致非常宽和成串的峰形，反压也会增加，因此对于粘度大的样品需要进行稀释。
样品体积：在凝胶过滤中，这是最重要的参数之一。一般推荐上样的体积在1-30%之间，可以做梯度实验，确定最佳的上样体积。
缓冲液组成和制备：
在凝胶过滤中，缓冲液的组成不直接影响获得的分辨率，更重要的考虑是，缓冲液对目标蛋白分子的形状和生物学活性的影响。选择的缓冲液和pH需要使蛋白保持稳定性和活性。缓冲液在使用之前，应当使用0.45um或者0.22um的膜进行过滤，在进行凝胶过滤之前，必须进行脱气处理。
层析柱：
凝胶过滤层析中，柱效尤为重要。由于分离过程中只有一个柱体积的缓冲液流过柱子，装柱柱床和颗粒的均一性影响流过柱子的一致性，因此影响峰形和最终的峰宽。高度均一的凝胶过滤填料有助于分子的窄峰洗脱。因此要尤为注意所用柱子的柱效。所以凝胶过滤层析柱装好之后，需要进行柱效的测定。
纯化过程：
1.在开始上样前，应将缓冲液和柱子维持在相同的温度。温度的快速交换会引起装柱中的气泡产生，影响分离。
2.样品进样方法取决于进样体积和进样使用的设备，可以通过色谱系统、蠕动泵或注射器直接上柱。
3.样品进入凝胶过滤层析柱后，不同分子量差异的分子在柱中流动的速度不同；为了获得良好的分离效果，应使用适当的流速，确保有足够的时间允许分子进入或流出柱子。低流速有助于获得更好的分辨率。如果在低流速时峰形分离良好，也可以增加流速或者缩短柱子以节省时间。
举例一些峰形出现的可能原因（图片源于GE）
