原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)与荧光原位杂交（四）
（2）硝酸纤维素滤膜吸印。
①将胶切成合适大小，切去右上角作为记号。
②将胶放进盛有变性缓冲液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH）的盘中轻摇动15min。
③换到中和缓冲液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl）中轻摇动30min。
④裁一张硝酸纤维素膜，2～4张3MM滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路），先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴橡胶手套操作。
⑤平盘上放一块比胶大的平板（盛胶槽翻过来即可），上面铺一张3MM滤纸，起灯芯作用，盘中加少量10×SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3MM滤纸充分饱和。
⑥将胶倒扣到3MM滤纸上。
⑦浸湿的硝酸纤维素铺在胶上，对齐，铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。
⑧膜上放一张3MM滤纸，不能与胶接触。
⑨上面加吸印纸及重物（500g左右）。
⑩通过滤纸的灶芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸。在室温下转印过夜。
⑾去除上面的东西，用镊了将膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗）。
⑿自然干燥，80℃烤2h。
⒀这时的膜就可进行杂交，或室温密封保存。
4．Northern印迹杂交（Northern
blot） 这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA
相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western
blot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行Northern转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含
5μg/ml EB的0.1mol/L
醋酸铵中10min，在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA
信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mR－NA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免
RNase的污染。
下面介绍RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法：
（1）试剂
10×MSE缓冲液：0.2mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0, 50mmol/L 醋酸钠，1mmol/l EDTA, pH8.0。
5×样品缓冲液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚蓝。
甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L）。应在通风柜中操作，pH高于4.0。
去离子甲酰胺。
50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。
0.1mol/L Tris·HCl，Ph7.5。
（2）步骤
①40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml 10×MSE缓冲液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混匀后 倒入盛胶槽。
②等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
③使RNA变性（最多20μg）：RNa 4.5μl，10×MSE缓冲液2.0μl，甲醛3.5μl，去离子甲酰胺10.0μl。
④55℃加热15min，冰浴冷却。
⑤加2μl 5×载样缓冲液。
⑥上样，同时加RNA标记物。
