毛细管电泳的应用前景（一）
一, 毛细管电泳的兴起与发展
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳(HPCE)是近年来发展最快的分析化学研究领域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm内径的毛细管内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳.1984年Terabe等[2]发展了毛细管胶束电动色谱(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛细管等电聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛细管凝胶电泳(CGF).1988—1989年出现了第一批CE商品仪器,1989年第一届国际毛细管电泳会议召开,标志了一门新的分支学科的产生.短短的几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分离分析的要求,得到了迅速发展,正逐步成为生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段.近三年来国际毛细管电泳会议与会者均达700—800人,1996,1997两年公开发表的有关CE论文达3600余篇.可参见相关综述则[5-8].欧洲,美国国内及日本也相继召开CE地区性国际会议.我国在CE领域研究起步早,发展快,研究工作较全面,有的研究成果达到国际先进水平.定期召开全国CE会议及亚太地区国际会议,在国际上已有一定的影响.1984年中国科学院化学所竺安教授在国内率先开展CE研究,迄今国内已有几百个单位开展CE研究和应用.从CE理论到各种模式及各方面应用,国内均在进行.1998年举行的第三届全国CE会议共收录论文129篇,同时举行的第二届亚太国际会议也取得了成功.毛细管电色谱(CEC),CE/MS联用,低背景毛细管梯度凝胶电泳,手性药物分离,逆流聚焦及脱氧核糖核酸(DNA)各种CE测定方法等一批研究成果均达到国际先进水平.
二, 毛细管电泳基本原理
CE是以高压电场为驱动力.以毛细管为分离通道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异,而实现分离的一类液相分离技术.仪器装置包括高压电源,毛细管,柱上检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮瓶,在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电泳.CE所用的石英毛细管在PH>3时,其内液面带负电,和溶液接触形成一双电层.在高电压作用下,双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极流动,形成电渗液.带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)二者的矢量和.带正电荷粒子最先流出;中性粒子的电泳速度为"零",故其迁移速度相当于EOF速度;带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反,因EOF速度一般大于电泳速度,故它将在中性粒子之后流出;各种粒子因迁移速度不同而实现分离,这就是毛细管区带电泳(capillary
zone electrophoresis,CZE)的分离原理.CZE的迁移时间t可用下式表示:
式中,μep为电泳淌度,μen为电渗淌度,V为外加电压,ιt为毛细管总长度,ιd为进样到检测器间毛纫管长度.理论塔板数N为:
式中,D为扩散系数.分离度R为<BR>式中,μ1,μ2分别为二溶质的电泳淌度,μep为二溶质的平均电泳淌度.
从式(11.2)可看出,CE的N是和溶质的扩散系数D成反比,而高效液相色谱
(HPLC)的N和D成正比,因此扩散系数小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分离能力,主要由两个因素决定:一是CE在进样端和检测时均没有像HP比的死体积;二是CE用电渗流作推动流体前进的驱动力,整个流体呈扁平型的塞式流,使溶质区带在毛细管内不易扩散,而HPLC用压力驱动使柱中流体呈抛物线型,导致溶质区带扩散,使校效下降
CE将经典电泳技术和现代微柱分离有机地结合,取得了比HPLC和平板凝胶电泳更多的优点.概括起来可谓三高二少一广.高质量灵敏度:常用紫外检测器检测限可达10-13一10-15mol,激光诱导荧光检测器(LIF)则达10-19一10-21mol.高分辨率:每米理论塔板数为几十万,高者可达几百万乃至几千万.高速度:许多分析可在几十秒内完成.所需样品少:只需纳升(10-9)的进样量.成本低:只需少量的流动相和低廉的毛细管.应用范围广;除分离生物大分子外,还可用于小分了(氨基酸,药物等)及离子(无机及有机离子).甚至可分离各种颗粒(如细胞,硅胶颗粒等).
CE发展迅速也得力于大批色谱工作者转向CE,在理论上提出了各种模型,如解释CZE中区带扩展及理论塔板高度模型,热影响模型,迁移速率和分离度模型等等[9-10].近年来基础研究集中于解决CE应用中一些关键性问题.如EOF对分离,定量影响极大,故研究了测弱EOF的方法,阳离于存在下的EOF,还有在两个中性标记物之间夹一个缓冲液塞的三明治式方法测定EOF [11].EOF测定将解决CE定量问题.电泳淌度定量计算也在发展,如用金属阳离子的一些结构参数,定量得出结构—保留(电泳)间的关系(QSRR) [12]及计算手性化合物淌度的软件等.特别是各种优化方法用于优化CZE,MECC,CEC及手性分离的实验参数,如重叠分离谱(OBM),多变量统计设计及Plackett-Buman多变量实验设计[13]等.
三, 毛细管电泳分离模式
按毛细管内分离介质和分离原理的不同,CE现有六种分离模式,分述如后.
毛细管区带电泳(CZE)
CZE分离机理是基于各被分离物质的净电荷与其质量比(荷质比)间的差异.迄今CZE仍是应用最多的模式,应用范围包括氨基酸,肽,蛋白,离子,对映体拆分和很多其它带电物质的分离.CZE常用介质为电解质水溶液,根据情况可加入不同有机溶剂或其它添加剂.还有一种非水CE,如在乙腈中加入嗡 盐(tropyltum)来分离多环芳烃化合物,现在发展到可不加支持电解质,直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶剂来进行非水CE[14].
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)
CGE是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳,不同体积的溶质分子在起"分子筛"作用的凝胶中得以分离.常用于蛋白质,寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分离和测序及聚合酶链反应(PCR)产物分析.CGE能达到CE中最高的柱效.为了解决人类基因组计划的关键,即DNA测序的速度,已试制出96支毛细管阵列的DNA测序仪,并已有8支毛细管阵列的DNA测序商品仪器.凝胶的制备和不同模式令人关注,最近发展出—种低背景毛细管梯度凝胶电泳[15],在测定糖,寡聚核苷酸及人工模拟蛋白方面取得进展.还有报道采用亲和凝胶电泳来识别和鉴定基于DNA药物的结合蛋白等.
3. 毛细管胶束电动色谱(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
采用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠,SDS)在运动缓冲液内形成一疏水内核,外部带负电的动态胶束相,利用溶质具有不同的疏水性,因而在水相和胶束相(准面定相)间分配的差异进行分离,既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式.MECC拓宽了CE的应用范围,主要用于小分子,中性化合物,手性对映体和药物等.常用表面活性剂有各种阴离子表面活性刑,阳离子表面活性剂,非离子和两性表面活性剂.也有用混合胶束,如阴离子表面活性剂和胆酸盐组合混合胶束.有报道采用脂肪醇的微乳液胶束电动色谱(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控制"窗口" [16].我们也成功地用MEEKC同时分离测定酸性和碱性蛋白.
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