E-玫瑰花环形成实验
[ 实验原理 ]
人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验（erythrocyte
rosette test）。应用最广的有总E花环试验（Et,t为total的缩写）和活性E花环试验（Ea,a为active 的缩写）。
Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。
E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。
[ 实验材料 ]
1.1%肝素水溶液。
2.Hanks'液(无Ca2+、Mg2+)PH7.4-7.6。
3.淋巴细胞分离液（市售商品）。
4.绵羊红细胞悬液：取新鲜绵羊血以1:1的比例与爱氏血球保存液混合，置4℃备用,2周内使用。
5.0.8% 戊二醛、姬姆萨染液。
6.离心机、水浴箱,显微镜等。
[ 实验方法 ]
1.无菌抽取患者静脉血1毫升,加入事先有0.05毫升肝素液的试管内,混匀抗凝。
2.加Hanks'液1毫升于上述试管稀释血液,然后缓慢加入盛有1毫升淋巴细胞分离液的试管中,注意不要打乱交界液面。
3.2000 转/分钟水平离心20分钟。
4.小心吸取血浆层和分离液层之间的白色膜状的淋巴细胞层,Hanks'液洗涤两次,最后用含20%小牛血清的Hanks'液将细胞调成 2X106/毫升。
5.将爱氏液保存的绵羊红细胞用 Hanks'液洗涤三次，弃上清，将压积红细胞用 Hanks' 液配成 1% 细胞悬液（ 8X10 7 / 毫升）。
6.Et 试验：将淋巴细胞悬液 0.1 毫升和绵羊红细胞 0.1 毫升混匀（细胞数合适比例为 1 ： 100 ）， 37 ℃ 水浴 10
分钟，低速离心 500 转 / 分钟， 5 分钟，再置 4 ℃ 2小时或过夜。取出后弃去大部分上清，轻轻摇匀，加0.8% 戊二醛 2
滴固定数分钟后涂片，自然干燥后加 1 滴姬姆萨染液，覆以盖玻片，高倍镜观察。凡淋巴细胞周围吸附 3 个或以上绵羊红细胞者为阳性花结细胞。
7.Ea试验:将淋巴细胞悬液0.1毫升和绵羊红细胞0.02毫升混匀（两者比例为1:20）,低速离心500转/分钟,5分钟,弃去大部分上清,轻轻摇匀,加0.8%戊二醛 2滴固定数分钟后涂片,其余程序同Et试验。
[ 实验结果 ]
随机计数 200 个淋巴细胞，记录其中形成花结的和未形成花结的淋巴细胞数,然后根据下列公式计算E花结形成百分率：E花结形成百分率 = 形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）X100%,一般正常值Et为50-70%,Ea正常值为 25—35%。
[ 注意事项 ]
1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且绵羊红细胞受体会从T细胞表面脱落。
2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。
