细胞核移植-2
（三）核移植
1. 显微注射器的准备：
每次手术前应向显微注射器的整个管道系统灌入手术液或双蒸水，检查管道的各衔接处有否漏气。管内只要有一极小的气泡，注射器的调节就失灵。同时应注意选择弹簧上弹性较灵敏的部位以便操作准确（图17.2，17.3，17.4）。
2. 微型吸管的制备：
吸管最好用软质玻璃管。制作前，先将玻管用洗液洗净，再用蒸馏水彻底将酸洗去。这样可使拉出的微吸管内部洁净，不致影响细胞核的吸入和射出。将玻管拉成口径1mm的细管，然后在微火焰上，再拉成微吸管，管径在10-20微米之间（图17.5，17.6）。
3. 吸细胞核：
吸核的方法不是将微吸管头刺入供体细胞内吸取细胞核，而是利用显微操纵台通过轻轻地来回转动千分尺外径，将一个细胞慢慢地吸入微吸管。必须注意微吸管的内径要比细胞小，这样能使被吸入的细胞由于吸力的作用而破裂，结果可以依靠目测，将细胞核和包在它周围的一部分细胞质一起吸入管内，避免细胞核直接与液体接触，以免受损。还应调节使供体细胞尽量靠近管口，避免注核时带入较多的手术液。
4. 注核：
将吸有供体细胞核的微吸管在离动物极45度左右的地方刺入动物半球的中心，再稍微向上提一下管口，然后轻轻地推动微量注射器，把管内的细胞核连同周围的细胞质慢慢地注入卵内。如果注射速度太快，注入卵内的压力过大，则会使卵子破裂，导致实验失败。
一般从首次去胶膜到注完15个左右的核，需2-2.5小时，时间过长，将会影响移核卵的发育。
5. 培养观察：
移核后的卵子转入1/10 Holtfreter 液中，置25℃恒温箱中培养。及时观察卵子的发育并做好记录。
6. 用同批卵按常规人工授精的方法获得受精卵，置培养皿中在同等温度条件下培养，以便与移核卵作对比观察。
二、哺乳动物的细胞核移植
1. 取卵：
取卵的方法与实验十六相同。
2. 去核卵的制作：
用白色小鼠的受精卵作受体，在有相差干涉装置的显微镜下，将预先备好的移核针管头端，借助显微操作器刺入受精卵的透明带，让针头仅穿过透明带而不刺破卵子的质膜。再用针口对准雄核，隔着质膜将其吸入针管内。然后将针口对准雌核，以同样的方法将雌、雄原核吸至针管前端，随即慢慢拔出针管。此时可见到卵子质膜弹性很大，在管口与透明带之间质膜被拉成细丝，然后断开，形成只有细胞质的去核卵和在针管内有两个原核和少量细胞质，外有质膜包裹的两个部分。该去核卵即作受体用（图17.7）。
3. 细胞核移植：
用同法将作供体的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入针管内，然后吸入少许仙台病毒（Inactivatied Sendai
Viras），再将上述针管移至去核卵，让管口穿过透明带原有的小孔进入卵周隙，此时轻轻转动注射器，使外有质膜包裹的雌、雄原核和仙台病毒一起进入受体卵的透明带与质膜之间的卵周隙，然后把针管缓缓抽出即可（图17.8）。如继续观察，能见到在病毒的作用下，移入细胞核所带的质膜与去核的质膜接触处，质膜慢慢溶化消失，雌、雄原核进入受体卵的融合过程。该移核卵子，实际是核质杂交。如果操作成功，在二氧化碳培养箱内培养，
90%以上的卵子可发育至胚泡期，经过胚胎移
植可获得核移植的核质杂交小鼠。
在核移植的全过程中，每一步骤均需严格操作，尽量减少对细胞膜、质和核的损伤，所用的器皿也需严格消毒，防止污染，以提高各个步骤的成活率。
实验材料
1.实验材料：
蛙受精卵，蛙囊胚晚期或原肠早期胚胎，昆明白小鼠，黑小鼠（C57BL―6）.
2.实验仪器：
显微操作器、显微注射器、拉针器、酒精喷灯、虹膜剪刀、尖头钟表镊、
内径0.5cm，0.3cm玻璃管、1mm玻璃毛细管、玻璃针、培养皿、弯头吸管、毛细吸管、微吸管、温箱、双目解剖镜、显微镜。
3.实验药品：
手术液：即 Holtfreter液，需煮沸消毒
分离液：
NaCl 0.35g
KCl 0.005g
双蒸水 100ml
待以上混合液煮沸消毒冷却后加入
EDTA(乙二胺四乙酸)18.6mg
NaHCO3 0.02g
Ringer液
70%酒精
2%琼脂
