PRIMO冷冻电镜在标准化细胞观察的应用（一）
（一） 总述：
冷冻电镜（ Cryo-EM）是观察细胞内分子构造的有力工具。然而，用冷冻电镜观察细胞
样本是具有挑战性的，细胞经常粘附在金属网格框架上，影响最终的成像质量。
用法国 Alveole 公司的 PRIMO“定制化细胞微环境制备系统”，其无掩模、非接触式的
微图案（ micropatterning）功能能为您的 TEM（ Transmission Electron Microscopy，透
射电子显微术）和 cryo-ET（ Cryogenic Electron Tomography，冷冻电子扫描断层成像术）
实验提供更好的细胞样本【 1】 ：
（ 1） 自动化细胞定位： 在电镜网格（ EM grids）的网眼（ mesh）中央进行精准的自动化细
胞定位；
（ 2） 标准化细胞模型： 微图案化设计可重复，可进行力学生物学研究；
（ 3） 电镜网格表面无损伤： 微图案化为非接触式 UV 投射，可保护电镜网格的表面完整性。
（二） 自动化细胞定位
PRIMO 的 LEONARDO 软件能检测到电镜网格的网眼，并自动在网眼的中央用 PRIMO 蚀刻
出对齐的微图案。这样就能保证细胞都定位在网眼的正中央，有利于电镜的成像观察。
图 1. 细胞在传统电镜网格中的定位和在 PRIMO 处理过的网格中的定位的对比【 2】：
（ a 图）： Hela 细胞在标准金网格（覆盖 SiO2 R2/1 多孔膜）中的冷冻扫描电镜（ Cryo-SEM ）
图像。可见大多数细胞都粘附在网格的框架上，只有少数细胞有较好的定位（箭头表示），
准备制作 FIB-lamellae（ focused ion beam-lamellae，聚焦离子束-晶片）。
（ b 图）：在金网格的网眼中加上一个直径 20µm 的纤维连接蛋白组成的微图案。拍摄 Hela
细胞在这个微图案化的网格中的图像，可见所有细胞都定位在网眼的正中央。白色的杂质为
冰晶的污染物。
（ c-d 图）：局部放大图： Hela 细胞，用 GFP 标记β -微管蛋白（蓝绿色）和用 mCherry 标
记组蛋白（品红色），分别种植在标准网格中（ c 图）和微图案化的网格中（ d 图）。可见
在微图案化的网格中（ d 图），细胞都定位在网眼的正中央。比例尺： 20µm。
图 2. PRIMO 对网格中央微图案化后，可保证细胞的定位适合进行 FIB milling 和 cyro-ET
成像【 2】：
（ e 图）：对（图 1， b 图）中的细胞进行 FIB 浅角度成像，黄色长方体表示准备 milling
的微图案。
（ f 图）：由（ e 图）中的细胞形成的最终的晶片（ FIB-lamellae）。
（ g 图）：是（ e 图）中细胞的核周围的断层扫描切片（ tomographic slice）， 6.8nm 厚。
显示细胞核周围的结构， NPC：核孔复合物； MT：微管。
（三） 标准化细胞模型
微图案化已被证明是一个控制体外细胞粘附的有效方法。因此， 此技术被广泛用于对细
胞形态和细胞内部组织进行标准化（使之直接与外部的粘附条件相关联）。
因为 PRIMO 的微图案化操作可以在电镜网格的网眼中自动加上排列一致的微图案，
PRIMO 已成为进行均质化和标准化冷冻电镜（ cryo-ET）实验的最佳工具。
进一步而言，在冷冻电镜观察细胞的实验中使用 PRIMO 进行微图案化，有助于精准地针
对特定的细胞内部元素进行成像观察，而用其他成像方法很难做到【 1】。
图 3. 微图案化可控制细胞的形态和细胞骨架结构【 2】：
（ a 图）： RPE1 LifeAct-GFP 细胞内的肌动蛋白微丝组织的活细胞共聚焦显微图像，该细胞
生长在 PRIMO 制造的微图案上（金网眼， SiO2 膜 R1/4）。黄色箭头：肌动蛋白应力纤维（ actin
stress fibers）。蓝色箭头：由 putative bundles 组成的肌动蛋白环（ actin rings）。
（ h-i 图）：一个生长在十字弓形状的微图案（黄色）上的细胞的扫描电镜（ SEM）图，微
图案由 PRIMO 制造。黄色长方体表示准备 milling 的微图案。
P1 和 P2 方块：图 4 中（ j 图）和（ k 图）的断层扫描切片（ tomographic slice）的位置。
