ACS Nano：基于本征无序蛋白域的相分离合成细胞器
代谢工程和合成生物学工具有潜力驯化微生物细胞工厂，这些工厂能够有效生产大量化学品和材料，包括大宗和特种化学品、生物燃料、聚合物和药物。所需产物的微生物生产可以通过在微生物底盘细胞中异源表达特定酶或整个合成途径来实现。过表达靶途径酶并减少甚至消除内源性竞争途径中酶的表达的策略已被广泛使用。
2023年5月16日，江南大学沐万孟团队在ACS Nano（IF=18）在线发表题为 “Phase-Separated Synthetic Organelles Based on Intrinsically Disordered Protein Domain for Metabolic Pathway Assembly in Escherichia coli” 的论文，该研究报道了基于本征无序蛋白域的相分离合成细胞器，用于大肠杆菌的代谢途径组装。
简单地高水平过表达工程途径或直接删除特定宿主菌株中的某些代谢节点可能会带来神秘的困境。例如，由此产生的代谢负担和流量失衡会扰乱自然细胞过程，降低目标产品的生产效率。作为一种有效的翻译后调节策略，将多途径酶空间组织到构建的人工支架中以加强靶途径代谢通量越来越受到关注。这种多酶聚类方法可以促进代谢通道的形成，这可以带来几个明显的优势，例如防止有毒中间体的积累，缓解中间体的扩散，以及通过增加酶和底物的局部浓度来提高转化效率。
几项研究开发了多种多样的多酶组装工具。例如，Lee等人开发了一种细胞支架系统，该系统由C末端修饰的Pdu（PduA*，在大肠杆菌中形成中空丝）、来自弗氏柠檬酸杆菌细菌微室（BMC）的单壳蛋白和两种互补的从头卷曲螺旋肽组成。靶蛋白（丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶）被成功地募集到细胞内丝上，从而提高了工程大肠杆菌菌株的乙醇产量。最近，研究人员受到I型模块化聚酮合成酶（PKS）的启发，开发了一种名为模拟PKS酶组装线（mPKSeal）的策略，通过该策略将顺序途径酶组装成多酶复合物。具体而言，将I型顺式AT PKS的对接结构域标记到虾青素生物合成途径酶上，进行多酶组装，使虾青素的产量提高了2.4倍。
文章模式图（图源自ACS Nano ）
作为典型的低复杂度序列之一，来源于秀丽隐杆线虫的LAF-1 RGG结构域已被证明可以在体外和体内进行液-液相分离（LLPS）并形成蛋白质缩合物。该结构域包含168个残基，具有频繁出现的精氨酸-甘氨酸−甘氨酸（RGG）序列基序。据报道，与单个RGG结构域相比，增加RGG结构域的化合价会产生更稳健的LLPS趋势。此外，将肽或货物蛋白基因融合到RGG结构域仍然可以触发相分离并形成特定的生物分子缩合物。这些特性使RGG蛋白成为构建合成无膜细胞器（MLOs）并进一步将靶蛋白募集到隔室中的一种有前途的替代品。
该研究表明RGG结构域可以作为理想的蛋白质支架，在工程大肠杆菌菌株中形成无膜合成细胞器和募集途径序列酶，从而改善目标产物的生物合成。具体而言，研究者证明了由绿色荧光蛋白融合的单个RGG结构域的过表达在大肠杆菌中产生了不同的蛋白质缩合物。接下来，研究者探讨了培养温度、表达水平和RGG结构域的不同价态对细胞内蛋白质缩合物形成的影响。然后，研究者证明了不同的细胞内容物蛋白可以通过直接与RGG结构域融合或与不同的蛋白质相互作用基序合作而被募集到合成区室。2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）从头生物合成途径用于测试此处构建的RGG介导的合成无膜细胞器系统的潜力。通过将顺序酶聚集到合成区室中，与具有未组装途径酶的菌株相比，2′-FL的滴度显著提高。
