MIDASTM确证Biomarker（二）
鉴定过程共进行两次实验，约30多种蛋白质被鉴定出来，已鉴定的蛋白质如表1所示，其中红色标注的蛋白又通过MIDASTM确认。两次实验结果相比较，重叠率低于75%。许多在第一次实验中被鉴定但可信度较低的蛋白质，第二次实验中并未产生更多的MS/MS图谱，没被再次鉴定出来，增加了鉴定与验证确认的难度。例如：在第一次实验中被鉴定的蛋白质RBM17 （RNA binding motif protein 17）（表1，#24），其鉴定结果仅被一个高分值的多肽（LLQSQLQVK）所支持，并经人工分析后鉴定出来（如图4所示）。但在第二次实验中，该蛋白质并没有被再次鉴定。此例说明需要更可靠的方法来验证并确认它在样本中是否真实存在。此应用实例中，选择表1中红色标示的4个蛋白质进行MIDASTM验证，确认其是否真实存在于样本中。
图4. 被鉴定的蛋白质RBM17，其鉴定结果仅被第一次LC-MS/MS实验的一个高分值的多肽所支持。
实验方法
样品制备
样品根据以前的方法制备[6]。简要的说，mRNA剪拼体复合物通过亲和纯化，而后通过甘油梯度离心后，样本被分离成亚复合物。这些亚复合物经过SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝染色。整个样本电泳泳道用胰蛋白酶进行?位酶解后，萃取并冻干酶切产物肽段。
高效液相色谱分离
酶切产物肽段用纳升级液相色谱（LC Packing 整机系统，Dionex公司）分离。经过C18预柱脱盐后，通过C18分析柱（75mm×15cm, PepMap, Dionex）分离。分离条件：5%~40%乙腈，0.1%甲酸，流速200nl/min，60min梯度洗脱。
MIDASTM工作流程设计器
每一个需要被进一步确认的蛋白质，其胰蛋白酶酶切后的肽段作为母离子被Q1选择出来，经过Q2碎裂后，在Q3中高特异性的检测其碎片离子。只有当上述三个四级杆的扫描条件同时满足时，信号才被记录。因此，上述MRM扫描模式是LC-MS/MS在复杂体系样本中最灵敏且选择性最高的检测技术。由于每个MRM传输只需5~50ms的驻留时间（Dwell time），所以一次运行中可以同时检测多达300个分析物，大量不同的多肽可以同时被扫描检测（如图5所示）。
图5. MRM引导的MIDASTM工作流程图，所有预期的胰酶酶切蛋白质所产生的多肽通过MRM扫描模式监测，验证其是否存在，一旦信号被检测到，仪器会立刻自动切换到高灵敏度MS/MS采集，从而确认蛋白质的真实性。
胰蛋白酶酶切后的多肽与它们的碎片离子所构成的母-子离子对，可以通过MIDASTM工作流程设计器软件计算出来。根据用户输入的蛋白质序列，此软件可自动计算并构建MRM扫描模式所需的母/子离子对，且不需要合成多肽或蛋白质参照物来设计MRM扫描条件。
质谱配合MIDASTM方法检测
使用NanoSpray离子源配合4000 QTRAP
LC-MS/MS进行MIDASTM检测。
数据库检索参数
验证过程中使用MASCOT 1.9（Matrixscience Ltd.）数据库检索引擎，检索NCBInr蛋白质数据库。简要参数设置如下：MS tolerance 0.2，MS/MS tolerance 0.3，Missed cleavages 0，No variable modefications。
结果
目标蛋白质验证与确认结果
此实验中所选择的4个蛋白质，MIDASTM工作流程设计器计算得出83个母/子离子对用于分析。此83个母/子离子对在实际LC-MS/MS实验中不断地被检测到（如图6上图所示）。实验中，一旦MRM扫描出现信号，指示有多肽母离子从色谱柱中洗脱出来，质谱仪立即切换至MS/MS扫描模式（每个肽段母离子，最多采集3次MS/MS图谱数据），采集到的数据经数据库检索后，用于再次确认洗脱下来的多肽是否是来自预期的蛋白质。
图6. MIDASTM工作流程确认实验，通过83个母/子离子的提取离子质量色谱图（XIC）确认4个蛋白质（上图），得到双电荷m/z894.4的MS/MS谱图的碎片离子确认RBM17的多肽序列为CVIFEIPGAPDDEAVR（下图）。
由于线性离子阱具有极高的灵敏度，即使在MRM扫描中非常低的离子信号，在线性离子阱MS/MS扫描中也可以获得高质量的MS/MS图谱来验证确认蛋白质。如图6下图所示，即使是丰度很低的肽段（CVIFEIPGAPDDEAVR），它的MS/MS图谱质量仍然很好，可以清晰地看到从脯氨酸氨基端碎裂而形成的y10离子。
数据库检索结果
通过MIDASTM方法，样本中被选择进行验证与确认工作的4个低丰度蛋白质都以高分值被验证，每个被确认的蛋白质MASCOT分值都高于100（图7上图所示）。蛋白质RBM17，被5个高分值的多肽所确认。其氨基酸覆盖率达到13.7%（图7）。
图7. 在MASCO检索结果中4个低丰度蛋白质都以高分值被验证（上图）。此外，蛋白质RBM17被5个分值都大于15的多肽序列所确认（下图）。
由于MIDASTM工作流程的高选择性与灵敏度，即便是在常规Nano-LC-MS/MS实验中模糊的鉴定结果，都可以准确地被验证其在样本中是否真实存在，避免了假阳性的结果，如图8所示。
图8. 4种目标蛋白质确认结果总结，蓝色和红色柱状图为标准LC-MS/MS 实验，绿色为MIDASTM工作流程确认结果。
结论
由于MRM采集方式的高选择性与灵敏度，非常适合在动态变化且体系复杂的样本中验证低丰度蛋白质的存在。
在此项实验中，结合4000
QTRAP线性离子阱串联三级四极杆质谱系统，基于MRM的MIDASTM技术方案成功验证了低丰度的4个蛋白质确实存在于人体mRNA剪拼体复合物中。与常规Nano-LC-MS/MS质谱仪蛋白质鉴定实验相比，由MRM引导的线性离子阱MS/MS扫描显著提高了氨基酸覆盖率，增强了可信度与准确性（图8）。
MIDASTM技术方案充分利用了QTRAP这类（线性离子阱串联三级四极杆）质谱系统的功能特点，既通过其三级四极杆的MRM扫描模式验证存在性，又利用其线性离子阱MS/MS扫描灵敏度高的特点确认真实性。因此，MIDASTM技术方法将在生物标志物的验证与确认领域发挥越来越重要的作用。
【参考文献】
1. Baldwin MA, Mol. Cell. Proteomics 3, 1-9 （2005）.
2. Panchaud A, Kussmann M and Affolter M, Proteomics 5, 3836-46 （2005）.
3. Chamrad DC, koerting G, Stühler K, Meyer HE, Klose J and Blüggel M, Proteomics 4, 619-28 （2004）.
4. Unwin RD, Griffiths JR, Leverentz MK, Grallert A, Hagan IM and Whetton AD, Mol. Cell. Proteomics 4, 1134-1144 （2005）.
5. Cox DM, Zhong F, Du M, Duchoslav E, Sakuma T and McDermott JC, J. Biomol. Tech. 16,83-90 （2005）.
6. Hartmuth K, Urlaub H, Vornlocher HP, Will CL, Gentzel M, Wilm M and Lührmann R, PNAS 99, 16719-24 （2000）
-
焦点事件
-
焦点事件
-
精英视角
