利用自动细胞成像系统分析细胞凋亡
简介
细胞凋亡是一种发生在多细胞生物体内的程序性细胞死亡过程！生化反应导致细胞形态和特征变化及细胞死亡。形态变化包括细胞收缩、核分裂、染色质凝缩、染色 DNA 分裂及 mRNA 衰减。细胞凋亡是一种高度调控的过程，通过内在途经对各种压力源做出响应，包括饥饿、感染、缺氧和氧化应激反应等。线粒体损伤在细胞凋亡的启动过程中发挥重要的作用。在外部通路中，外部信号介导了细胞凋亡的产生，包括肿瘤坏死因子受体家族介导信号。以上两种途径以及细胞死亡进行过程都通过激活 caspase 激酶来实现。细胞凋亡调控过程的破坏与包括癌症在内的许多疾病相关。在这篇应用中，我们介绍一种利用自动细胞成像系统进行细胞凋亡检测的方法。
实验材料 |
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实验方法
将人宫颈癌细胞系 HeLa, 培养在 Greiner 公司黑边底透的 96 孔多孔板中，每孔 5,000个细胞，37°C, 5% CO2 条件下过夜培养。第二天，分别用不同浓度的抗肿瘤化合物十字孢碱 (Staurosporine)、丝裂霉素 CMitomycin C) 和喜树碱 (Camptothecin)处理这些细胞诱导凋亡。化合物的最高浓度分别为：10 μM 十字孢碱；200 μM 丝裂霉素 C；100 μM 喜树碱。加药处理 18 小时后，使用试剂盒 EarlyTox™ Caspase-3/
NucView 488 dye 和 Ethidium HomodimerIII 染料以终浓度 5μM 和 3μM 分别对细胞染色 30 分钟, 之后用 Hoechst 33342以终浓度 6 μM 对细胞进行染色，同时将细胞放回 37°C, 5% CO2 培养箱中静置15分钟。
EarlyTox Caspase-3/7 NucView488 试剂盒
Caspase-3、caspase-7 是在细胞程序性死亡过程中被激活的蛋白酶。EarlyTox试剂盒中的 Caspase-3/7 NucView 488底物用来检测完整细胞中 caspase-3/7 活性。底物由一种与 caspase-3/7 DEVD 识序列结合的荧光 DNA 染料组成。最初没有荧光，底物透过细胞膜进入细胞质中。在凋亡细胞中 caspase-3/7 将底物裂解，释放出的高亲和 DNA 染料与细胞核中的 DNA 结合，在 500 nm 激发光照射下在 530 nm 处发出明亮的绿色荧光，可以用来评价 caspase 激酶的激活水平。Hoechst 33342 核染料用来确定细胞总个数，Ethidium Homodimer 用来确定死细胞 ( 即外膜受损的细胞 ) 的个数。
使用自动细胞成像系统评价细胞凋亡
染色之后，使用 ImageXpress® Pico 自动细胞成像系统，在 10x 物镜条件下对细胞进行成像。每个成像位置分别采集 DAPI,FITC 和 TexasRed 三个荧光通道，曝光时间分别为 20, 500, 和 50 ms。图1 展示了对照细胞及实验组细胞结果，其中实验组的化合物浓度分别为 0.3 μM 十字孢碱、10 μM 丝裂霉素 C。Hoechst 染色为蓝色，凋亡细胞核为绿色，死细胞核为红色。使用 CellReporterXpress 软件中的凋亡分析流程采集样品图像并进行分析，得到凋亡细胞数量和百分含量。同时，通过分析 Ethidium Homodimer 染色结果得到死细胞数量，通过分析 Hoechst 染色结果得到细胞总数的相关参数。根据实验结果生成细胞凋亡、死亡的浓度效应曲线及相应的半最大效应浓度 (EC50) 值见图2。值得注意的是激酶抑制剂十字孢碱 ( 一种已知的细胞凋亡诱导物 ) 的 EC50 值比通过不同的机制介导细胞调亡的丝裂霉素 C低 100 倍左右。
结论
EarlyTox 试剂盒是一种有效的工具，可用于疾病生物学研究、抗肿瘤药物评价及细胞健康状况监测等领域。本篇应用介绍了一种利用 ImageXpressPico 全自动成像系统和 CellReporterXpress 软件对 Early-Tox 试剂盒染色的样品进行凋亡细胞量化和评价的方法和流程。
参考文献
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