亲和免疫组织化学实验—— CSA法
| 实验方法原理 | 催化信号放大系统（catalyzed signal amplification system，CSA），也称酿胺信号放大（tyramine signal amplification system，TSA）或称 CARD（catalyzed repoter deposition）。 该方法的主要原理是酪胺的过氧化物酶反应（即 HRP 在 H2O2 存在下催化酪胺盐，形成共价键结合位点），产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素-HRP 结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过 DAB 的显色反应，其敏感性得到几何级放大。其感性较常规 LSAB 法要高近 1000 倍，特别适用于石蜡切片较难检出结果的组织片。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 生物素 N-羟基丁二酸亚胺酯酪胺盐二甲基甲酰胺三乙醇胺硼酸缓冲液2 4 6-三硝基苯亚磺酸蛋白酶PBSH2O2特异性一抗生物素化二抗链霉亲和素-HRP树胶 |
| 实验步骤 | 实验试剂制备流程： ①A 液：临用前将 Bio-NHS 溶在 DMF 中（10 mg/ml）。 ②B 液：10 mg/ml 酪胺盐溶在 DMF 中（相当于 58 μmol/L），加入 1.25 倍量的 TEA（从 7.2mol/L 的贮存液中取 10 μl）。 ③C 液：在 A 液中加入 1.1 倍摩尔浓度的 B 液，在暗处使充分酰化 2 h，最后用乙醇稀释到 1 mg/ml。C 液在 4℃ 中可保存 8 个月，临用前加入终浓度为 0.003％ 的 H2O2。可 1:500 稀释。 步骤： 1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水，PBS 洗 3×3 min。 2. IHC 的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化，或热诱导的微波抗原修复（AR）。 3. PBS 洗 3×3 min。 4. 3％ 过氧化氢孵育 10 min（可省略），以阻断内源性过氧化物酶活性。 5. PBS 洗 3×3 min。 6. 20％ 蛋清 [ 用 0.01 mol/L（pH 7.3）PBS 配制 ] 孵育 20 min。 7. PBS 洗 3×3 min。 8. 10％ 非免疫性动物血清孵育 10 min（可省略），以减少非特异性背景，无需冲洗，只需吸去多余血清。 9. 滴加适当稀释的第一抗体（在 S-P 法基础上 5～10 倍稀释），37℃ 孵育 60 min，或 4℃ 过夜。 10. PBS 洗 3×3 min。 11. 滴加生物素化二抗，37℃ 孵育 30 min。 12. PBS 洗 3×3 min。 13. 链霉亲和素-HRP37℃ 孵育 30 min，PBS 洗 3×3 min；0.007mol/L 生物素化酪胺酰胺（内含 0.03％ H2O2）37℃ 孵育 12 min，PBS 洗 3×3 min。 14. 链霉亲和素-HRP 37℃ 孵育 15 min，PBS 洗 3×3 min。 15. 如果信号弱，还可以从第（14）步开始重复几次，使阳性信号获得明显改善为止。 16. 0.04％ DAB（含 0.03％ H2O2）显色 5～10 min。 17. 复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。 展开 |
