实验室分析方法--亲和色谱法原理及发展
亲和色谱(AFC)作为一种特异性分离技术,基于生物分子的活性特征,以其极高的选择性不可替代地被应用于复杂生物体系中特定组分的分离。
一、原理与色谱柱推荐
亲和色谱基于生物分子固有的特异性相互作用进行样品的高选择性分离。特异性相互作用包括醇能与底物、抑制物、辅酶等的结合:;抗体与抗原的结合:凝集素与细胞表面抗原以及某些糖类的结合等。其分离原理如图1所示。
图1 亲和色谱分离原理
将可以与目标分离分子产生特异性相互作用的分子固定在固定相基质上,复杂样品基质中的分子由于不存在这种特异性作用,因此与固定相的作用相对较弱,被率先洗脱。目标分子最后被洗脱。
依亲和色谱固定相所带配基与样品之间相互作用可将其分为专用型和通用型两类。亲和配基既可以与基质直接偶联,也可以通过间隔臂间接连接(图2)。
图2 通过间隔臂间接连接配基
适当的间隔臂可以有效地克服基质表面的位阻效应,使得配体更容易与被分离物结合,带有间隔臂的AFC固定相往往具有更为优异的色谱性能。对以小分子为配体分离大分子的亲和固定相来说,间隔臂的作用显得更为重要。AFC固定相的间隔臂按其结构类型,主要包括烃类、链状的聚胺类、肽类、链状聚醚类等。氨烷基化合物NH2(CH2)nR,R是常用的间隔臂,其中,R可为羧基、羟基、氨基或配位体自身。具有疏水性的间隔臂可能与配基或样品间产生非特异相互作用,干扰亲和分离。为消除非特异性吸附干扰,可在沿间隔臂分子的长轴方向某些原子上偶联亚氨基、羟基等官能团,增加亲水性。
亲和色谱固定相上固定的配基包括染料配基、金属离子配基、包合配合物配基、特异性民基、电荷转移配基和共价配基。三嗪活性染料的结构与生物酶的天然底物接近,可与酶活蛋白质的活性位点结合应用于亲和色谱。Cu2+、Zn2、Ni2+、Fe2+、Fe3+等金属离子通过具有整合作用的有机官能团固定在基质或间隔臂上,利用螯合物中的金属离子与生物分子间的特异性亲和作用实现生物分子的分离或纯化。常用的螯合剂包括亚氨基二乙酸、亚氨基二乙醛、肟、硫脲、吡啶咪唑、8-羟基喹啉等。
包合物配基由主体与客体分子间特殊亲和作用力形成,主体化合物具有环状知或穴,客体分子可以被包合在环内或空穴内形成包合物。常用的主体分子包括环糊精、、杯芳烃等。
三、流动相
为了保持生物分子的活性,一般需要采用温和的洗脱条件。亲和色谱中通常采用具有不同pH的缓冲溶液作为流动相,缓冲体系由无机或有机弱酸、弱碱与其盐组成。为保持分子的活性:P值保持在6~8之间。满足这一条件的冲体系较少,包括酸盐、三基)氨基甲烷(Tris-HCI)、硼酸盐等。磷酸盐缓冲溶液缓冲容量较小,且容易与高价阳离子生成沉淀,并在很多代谢体系中起到抑制剂的作用。Tris-HCl体系在pH<7.5时缓冲容量小有较强反应活性,也同样对很多代谢体系有抑制剂作用。硼酸盐体系可与众多生物有机物成配合物影响分离。甘氨酰甘氨酸在pH>8时缓冲能力极强,但pH=7.5以下几乎没有缓符作用。
由Good等计研发的Goods系列冲溶液包括12种缓冲溶液,具有缓冲能力强、低子强度等特征,可在pH=6.1~10.7范围内应用于生物学和生理学研究。
通用型亲和配基与溶质之间作用力通常不强,大多数情况下非选择性流动相即可完成不同组分的分离。当生物分子与配基形成稳定常数较小的配合物时,等度条件下,采用洗脱能力弱的、具有不同pH值的缓冲溶液即可使配合物解离实现洗脱。当除了配位作用,还有静电吸引力、氢键力或疏水相互作用等引起的非特异性相互作用存在时,可通过改变p出值离子强度、流动相极性、加入离液序列试剂等消除其干扰。其中离液序列试剂可改变生物分子结构,使蛋白质变性从而破坏亲和作用。采用低浓度离液序列试剂能够在尽可能保持蛋自质分子结构基础上实现快速洗脱。
专用型亲和配基与目标溶质间亲和作用较强,需要采用含有特定组分、具有超强洗能力的流动相进行洗脱。此时,通常在流动相中加入另一种游离配基以取代固定相上的配基与目标化合物结合实现洗脱。此外,还可以通过选择性断裂固定相基质与配基之间的化学键的方法实现洗脱。由于洗脱后目标分子仍与配基相连,需采用适当方法(如改变pH值或加人变性剂等)将其游离出来。
三、方法发展
在亲和色谱分析中,分离、纯化的对象皆为氨基酸、多肽、蛋白质、核破、核苷、核苷酸、寡聚和多聚核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸以及酶、辅酶、寡糖、多糖等生物分子,其中大多数为极性化合物,不少还具有生物活性。因此,当从固定相上将它们洗脱下来时需使用H值接近于中性的稀缓冲溶液,以在比较温和的洗脱条件下,保持其生物活性。亲和色谱分离进行前,需先对固定相进行平衡,平衡缓冲溶液的pH、离子强度、温度和化学组成都应使配基与溶质之间产生较强的相互作用以利于保留。温度是亲和色谱分离的重要条件,亲和作用强度通常随温度升高而减小,可利用不同的温度吸附和脱附。配基与生物分子间相互作用达到平衡的过程缓慢,样品应以较慢速度加载,流动相流速也不应过快。对亲和力较强的固定相,样品体积的影响不大;亲和力较弱时,样品体积不宜过大。梯度洗脱时,可采用温度梯度、pH梯度或离子强度梯度。
