液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素B1
1.适用范围
本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素B1含量的检验。
2.原理概要
样品用三氯甲烷提取，提取液经硅胶柱净化，净化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。
3.主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
三氯甲烷;
正己烷;
苯;
甲醇：紫外光谱级;
乙腈：紫外光谱级;
三氟乙酸;
乙腈-水溶液(1+1);
三氯甲烷-甲醇溶液(95+5);
苯-乙腈溶液(98+2);
黄曲霉毒素B1标准品：纯度≥99%;
黄曲霉毒素B1标准溶液：准确称取适量的黄曲霉毒素B1标准品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成浓度为10μg/mL标准贮备液。根据需要，再配成适当浓度的标准工作溶液。
3.2.仪器
液相色谱仪，配有荧光检测器;
硅胶小柱：Waters Sep-pak Silica前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱;
振荡器;
旋转蒸发器，配有100mL具尾管的圆底烧瓶;
微量注射器;
离心管：5mL具塞磨口;
粉碎机;
滤膜：有机系用，0.45μm;
微孔滤膜过滤器：有机系用，0.5μm。
4.试样的抽取与制备
4.1.检验批
以不超过2000件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等级等。
4.2.抽样数量
批量，件 最低抽样数，件
1～5 1
6～50 2
51～500 11
501～1000 16
1001～1500 19
1501～2000 20
4.3.抽样方法
从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取2.2规定的件数，逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上，用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约500g。将所取样品充分混匀，用四分法或分样器逐步缩分出500g，装入洁净密封的样品筒内，加封后，标明标记，及时送实验室。
4.4.试样制备
将所取回样品全部磨碎，通过20目筛，混匀，均分成两份试样，装入洁净容器内，密封，标明标记。
4.5.试样保存
将试样于室温下保存。
注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
5.过程简述
5.1.提取
称取试样5.0g(精确到0.1g)置于100mL具塞锥形烧瓶中，加入15mL三氯甲烷，于振荡器上提取30min，然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内，并用三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至约20mL。
5.2.净化
用旋转蒸发器将上述滤液在50℃水浴中浓缩至约1mL，经0.45μm滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。用2～4mL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱，弃去流出液。然后用3～4mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒钟2滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干，供衍生用。
5.3.衍生
5.3.1.试样
加200μL正己烷和50μL三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液(1+1)定容至1.0mL，超声1min，用0.5μm滤膜过滤，滤液供液相色谱用。
5.3.2.标准工作溶液
取1.0mL标准工作溶液，用氮气缓缓吹干，按5.3.1步骤操作。
5.4.测定
5.4.1.色谱条件
色谱柱：NOVA PAKc18，300mm×3.9mm(内径);
流动相：甲醇-水溶液(42+58);
流速：0.8mL/min;
荧光检测器：激发波长375 nm，发射波长425 nm;
色谱柱温度：室温。
5.4.2.测定
根据样液中黄曲霉毒素B1的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参**样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒素B1衍生物保留时间约为8min。
5.4.3.空白试验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。
6.结果计算
用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素B1的含量：
X= A·cs
As·c
式中：X -- 试样中黄曲霉毒素B1的含量，mg/kg;
A -- 样液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2;
cs -- 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，μg/mL;
As -- 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2;
c -- 最终样液所代表试样的浓度，g/mL。
注：计算结果需扣除空白值。
7.低限和回收率测定
7.1.低限
本方法的测定低限为0.001mg/kg。
7.2.回收率
回收率的实验数据：黄曲霉毒素B1的添加浓度在0.001～0.5mg/kg范围内，回收率为89.1%～104.9%。
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