血球计数板的设计与使用发展史
引言
血球计数板作为医生和生物学家的必备工具已经有超过100年的历史，它最初被医生用来研究病人的血液样品，并由此开创了“血液学”这个研究领域。在十八世纪和十九世纪早期，血球计数板经历了一系列的重大发展。Jack
David Davis在论文“The Hemocytometer and Its Impact on Progressive-Era
Medicine”中对血球计数板的发展历程做了详细介绍[1]。在此我们为大家提供Davis论文的简介，以期广大读者能够了解血球计数板的前世今生。
血球计数板的发展
1852年，德国科学家Karl Vierdordt (1818-1884)发明了第一个精确计数红细胞的方法。他使用内径和长度分别为0.1-0.2 mm和5-8 mm的毛细管吸取血液样品；在样品加载到毛细管之后，就可以通过测量毛细管内径和样品长度来获得精确的样品体积；之后将血样涂到包被了蛋清的玻璃板上并晾干；最后使用配备刻度目镜的显微镜对细胞进行计数。虽然这种方法费时费力，但可以获得非常精确的计数结果。
二十二年后的1874年，Louis Charles Malassez
(1842-1909)发明了一种新的细胞计数方法。如图1所示，他将扁平的毛细管粘合到玻璃板上作为计数室。玻璃板上带有标尺，可以将毛细管长度转换为样品体积。通过计数毛细管中红细胞的数量，再乘以稀释倍数就可以获得细胞浓度[1,
2]。
1875年，Georges Hayem (1841-1933)发明了另一种计数板。他在玻璃板上粘上一块0.2 mm厚，带有直径1
mm孔洞的玻璃片（如图）。一滴血样直接加到孔里，然后盖上盖玻片。接下来使用带有标尺（0.2 mmX0.2
mm）的显微镜进行细胞计数，结合孔洞高度（0.2
mm）就可以计算获得细胞浓度（图2）。由于样本的加载没有通过毛细管作用，细胞的分布并不均匀。虽然Hayem制造并销售了他的产品，但因为准备步骤的繁琐和存在计数一致性较差的问题而没有获得广泛接受
[1, 2]。
1877年，William Gowers
(1845-1915)改进了Hayem的计数板，简化了计数方法。因为之前的计数方法需要特殊的显微镜（带有校准过标尺的目镜），使用非常不方便。William与Hawksley合作发明了第一个直接在玻璃板上带有标尺的计数室。标尺设计成0.1
mmX0.1 mm的方格，计数室厚度是0.2 mm，由此可精确确定样品体积以及细胞浓度（图3）。1906年，William将标尺优化为0.1
mmX0.2 mm的长方格。但因为没有在行业期刊上发表，William的计数板也没有获得广泛接受 [1, 2]。
接下来的改进由Richard Thoma (1847-1923)在1881年完成，主要是计数室高度的定型和网格的增加。他首先将一块中间有11
mm直径圆孔的玻璃片粘贴到玻璃板上，然后在圆孔中央再粘上一块直径5 mm的玻璃圆片。外层玻璃片比内层玻璃片厚0.1
mm，因此自然形成了一个高度为0.1 mm的计数室。玻璃板底部中央1
mm2的区域被划分成16个中方格，每个中方格再分为25个小方格；每个中方格的大小是0.25 mmX0.25 mm
（图4）。这种计数板由卡尔蔡司公司和耶拿公司制造。
1884年，俄国科学家Sergei
Alferow设计了新型的计数板。Alferow的计数板通过两条平行的沟槽将计数室与板分开。计数室的高度通过四个带刻度的螺丝控制，样品通过毛细管作用加入计数室，以增加细胞在计数室中分布的均一度
（图5）。Alferow是第一个对计数板中细胞进行显微拍照的人。他将照片投射在带有刻度的玻璃板上，再用铅笔将每个细胞标识和计数。他相信他的方法能得到更准确的结果，因为显微照片是计数板中细胞状况最真实的记录
[1, 2]。
1903年，W. Brünings发明了一种集混样和加样于一体的计数板。他将计数板和一个混样室用吸液管连接。当血样在吸液管内混合后便会被直接转移至计数室（图6）。这种计数板可以称得上是“芯片实验室技术”的最早应用了[1, 2]。
对提高血球计数板易用性和精度做出最大贡献的是Karl Bürker
(1872-1957)。Bürker的计数板由一块重玻璃板和粘到玻璃板上的三个平台构成。三个平台在玻璃板上平行排列；中间的平台（25 mm x 5
mm）被一段1.5 mm宽的沟槽分成两部分，两端呈圆形；两侧的平台(21 mmx 7.5 mm)比中间的平台高0.1 mm，与其被一条1.5
mm宽的通道分开。盖玻片盖到两侧的平台上之后，就形成了0.1 mm的深度。中间平台的两部分各有一个标尺，标尺面积是1
mm2，被划分成了400个小方格。Bürker的计数板通过毛细管作用加载样品；计数板上有两个计数室，无需清洗就可以对样品进行重复计数（图7）。通过这一系列成功的改进，Bürker的计数板成为1921年前最常用的一类血球计数板
[1, 2]。
血球计数板网格的改进
血球计数板的网格经历过多次改良。Thoma在1879年的设计的网格为早期的血球计数板奠定了基础。但随着血液学研究的发展，科学家们发现这样的网格不适合白细胞的检测，因为白细胞的体积比红细胞和血小板都大。
1892年，J. Zappert将网格的面积扩大至9 mm2，由九个1 mm2大小的区域组成。1894年，A.
Elzholz在左侧和右侧各增加了三组竖线。1902年，W.
Türk在Elzholz的基础上又增加了三组横线。此时的网格已与当今的血球计数板类似。1907年，O.
Neubauer将双线改为了单线，进一步简化了网格的设计（图8）[1]。
总结
经过一个世纪的改进，血球计数板从其雏形发展成了现今全世界通用的精密工具（图9）。虽然血球计数板有不同的型号，但无论在实验研究还是临床诊断领域，它依然是细胞计数的金标准。在下一篇文章中，我们会和大家分享使用血球计数板进行细胞计数的误差来源和减少误差的方法，以提高细胞计数以及下游实验的准确度。
参考文献
【1】Davis, J.D., THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE, in Department of History1995, University of Illinois at Urbana-Champaign: Urbana. p. 268.
【2】Verso, M.L., Some Nineteenth-Century Pioneers of Haematology. Medical History, 1971. 15(1): p. 55-67.
【3】Rouge, M. Counting Cells with a Hemacytometer. 2002; Available from: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/hemacytometer.html.
