毛细管电色谱仪分析技术（一）
毛细管电色谱仪（CEC）整合了液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）的优点，在毛细管柱中填充固定相颗粒、管壁键合或涂覆固定相、制成连续床固定相，以压力和电渗流共同驱动流动相，利用样品各组分在固定相和流动相中分配系数差异和本身淌度差异进行分离。在HPLC和CE双重分离机理的作用下，CEC对样品细微之处的分辨能力得到极大提高，既能分离带电组分，又能分析中性分子，对复杂的混合样品显示出强大的分离潜力，代表微分离分析的趋势。
一、发展历史：
1974年，CEC出现，将电场施加到填充毛细管柱上，分离了数种溶质，显示出以电渗流作为驱动力的优越性。但当时并没有引起足够的关注。
1981年，将10μm ODS填料填入170μm内径的毛细管柱中，在电场作用下成功分离了数种多环芳烃，获得了31000TP/m的柱效，*次展示了CEC的巨大潜力。
二、工作原理：
CEC采用HPLC固定相，通过高压输液泵产生的液压和在毛细管柱两端加上高压直流电场所产生的电场力，即依靠液压和电渗流共同驱动流动相，使样品组分根据它们的色谱行为和电泳速度的不同而达到分离。CEC具有HPLC和CE双重分离机理，如同HPLC基于组分在固定相和流动相中的分配过程，如同CE基于组分的电迁移过程，使分离选择性得到极大提高。电渗流的塞形流型改善了组分在毛细管柱中的流型和峰展宽，可获得远高于HPLC的柱效，对复杂样品的分离能力远远超过单独使用HPLC和CE。
三、输液系统：
1、驱动流动相的动力：
以高压输液泵和电渗流泵共同驱动流动相，流动相在液压和电渗流的共同作用下通过毛细管柱，可稳定输送几百纳升的流量。液压和电压可同时或独立地施加在毛细管柱两端，具有以下明显的优势：
（1）可有效抑制分离体系中气泡的产生。
（2）采用压力流和阀进样，可方便地实现二元溶剂梯度洗脱，提高分析的灵活性、选择性和分离速度。
（3）从进样到分离的整个过程中，高压直流电场不间断，保证了系统的稳定性和分析的重现性。
2、微流控制系统：
微流控制系统由分流阀、反压阀、溶剂混合阀、定量进样阀和限流阀等组成。
（1）分流阀和反压阀：
维持恒定的毛细管柱前压是色谱体系稳定的关键，可通过分流阀和反压阀来实现。溶剂由高压输液泵以恒流形式泵出，在分流阀处转为恒压形式驱动，从而与高压直流电场的电渗流相匹配，实现由样品压力和电场对柱内溶剂的同时驱动。
（2）溶剂混合阀：
50μL溶剂混合阀可实现二元溶剂的梯度混合，在保证混合效率的同时，抑制了梯度延时，保证了分析的准确性和重现性。
（3）定量进样阀：
定量进样阀为纳升级定容进样，保证了进样的准确性和重复性。压力流和进样阀的存在，使系统可与样品处理相连，实现实时在线样品分析。
该阀采用内置定量环，通过刻蚀实现纳升级定量环的加工。定量环的出口通道为100μm，可通过PEEK接头与100μm内径的毛细管柱相连，极大地抑制了死体积的影响。
（4）限流阀：
限流阀的作用是在毛细管柱的出口端保持一定压力，可抑制由于压力骤然变化引起的气泡，保证系统的稳定性。
（5）微流控制系统的连接管路：
微流控制系统的连接管路的内径与定量进样阀接口处的孔径相同，从zui大程度上减小了进样死体积和柱外体积的影响。
四、高压直流电源：
1、0～30kV稳定、连续可调的直流电源。
2、具有恒压、恒流和恒功率输出。
3、具有电场强度程序控制功能。
4、电压稳定性在±0.1%。
5、电源极性易转换。
五、固定相：
固定相是影响电色谱柱柱效、分离选择性和分离速度的重要因素，是发展新型CEC分离模式的基础。
固定相的选择主要依据HPLC的理论和经验。HPLC的各种固定相已被应用于CEC中，其中十八烷基硅烷键合硅胶固定相（ODS）应用zui多。CEC结合了HPLC和CE的动力优势，不单纯依靠压力驱动毛细管柱中流动相的流动，还通过在毛细管柱两端加上高压直流电场所产生的电场力驱动，大大降低了柱内压力。因此，CEC进行分析时，可使用内径细小的毛细管柱和粒径超小的填料（1.5～3μm），而不用担心高反压，大大提高了柱效和分离效果。实验表明，只要固定相颗粒粒径≥0.5μm，电渗流速度与固定相颗粒大小和填充均匀程度无关。
分离手性化合物时，可在固定相上键合手性选择剂，也可用非手性固体相在缓冲液中加入手性选择剂进行拆分。
混合官能团固定相是专门针对CEC研制的新型固定相，是在硅胶表面同时键合具有反相色谱性能的烷基官能团和具有离子交换性质的磺酸官能团，在很宽的pH范围内都能保持良好的电渗流。
六、流动相：
根据固定相的正相和反相等特性，流动相可以是水溶液或有机溶液。常用流动相有乙腈－水、甲醇－水等。
七、电色谱柱：
电色谱柱是CEC的核心部件，按固定相形式不同可分为填充毛细管柱、开管毛细管柱和整体毛细管柱。
1、填充毛细管柱：
填充毛细管柱是将固定相填充到毛细管中，通过两端烧结柱塞将固定相保持在毛细管中而成。其zui大优点是可利用众多的HPLC固定相，根据化合物与固定相的作用不同实现分离，在CEC中应用zui广泛。
（1）制备方法：
1）柱塞：
柱塞制备对填充毛细管柱非常关键。
①柱塞必须满足的要求：
有足够的机械强度，能承受填充时的高压。
化学惰性，耐有机溶剂和宽pH值的缓冲液。
有合适的孔隙度，既不使流动相受阻，又可防止固定相颗粒通过。
死体积小，避免峰展宽。
②柱塞制备方法：
柱塞制作方法很多，目前应用较多的是水玻璃烧制法和填料直接烧制法。
2）填充毛细管柱：
填充毛细管柱的填充方法有高压匀浆填充法、电动填充法和超临界CO2法等。
①高压匀浆填充法：
高压匀浆填充法是填充毛细管柱zui常用的制备方法。
填充过程一般包括烧结进样端柱塞、高压填充、烧结出口端柱塞、除去不需要的固定相和检测窗口制作等步骤。
高压匀浆填充法简单，快速，但操作技术要求较高。由于在分离样品时施加电场，会使表面带电荷的固定相沿某一方向电泳，容易造成柱局部过于紧密产生较大的压力，而局部由于固定相迁移形成较大的空隙。
