激光扫描共焦显微镜技术及应用（二）
五、激光扫描共焦显微镜技术的应用
定位、定量
三维重组
动态测量
¨ 活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量
¨ 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量
¨ 自由基的检测
¨ 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量
应用：细胞膜电位的测量
荧光漂白恢复（FRAP）的测量
笼锁解笼锁的测量
荧光能量共振转移（FRET）的测量
其他应用
1、定位、定量
免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量。如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位
细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
荧光原位杂交： 染色体基因定位
单细胞凝胶电泳
GFP的表达
游离Ca2+ 的分布与定量
定位、定量研究中常用荧光探针
1）Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）异硫氰基荧光素 494/518
4）TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻红蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690
(1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白
免役荧光标记： 与抗体耦联,
直标: 一抗+荧光探针
间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针 肌动蛋白 Palloidine+荧光探针
(2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)
标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC
2.标记细胞器荧光探针
(1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短
JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光
线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光
可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电
位最佳探针: Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,
稳定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞
(2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red
(3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体
(4)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体
(5)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活细胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死细胞
SYTO 活细胞
3. GFP 绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白
GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光
。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.
GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的
结构及病理过程:定位与定量测量应注意的问题
定位：1.可以对图像进行修饰，
2.pinhole 可尽可能的小。
3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像
定量：
1.仪器的各个条件必须一致
2.必须用原始图像进行定量测量
3.Pinhole尽可能的大
六.显微CT与三维重组
光切的层数：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.动态测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量
1).游离Ca2+测量
检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd,
Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n
M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
荧光探针 激发波长 发射波长 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM
相对 测量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+浓度绝对测量
单波长公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)
Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)
测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）
细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）
细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
标准曲线法：根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度
比例荧光的测量：双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2
细胞器的Ca2+测量
1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）
2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光
用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化
目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测
细胞内游离Ca2+测量的应用：
钙的特性
1．细胞内外的电化学梯度103-104倍
2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高
3．细胞内钙为细胞激活“开关”
细胞内钙的生理作用
1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联
2．神经递质的释放
3．学习记忆的增强
4．卵子受精
5．细胞分裂和再生
6．细胞调亡
7．细胞间通讯
8．细胞信号传导
9. DNA合成
10. 基因表达
细胞内钙超载与疾病
1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常
2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高
3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高
4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高
细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M），细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
八.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率, 或分子运动速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度
应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动
九.笼锁解笼锁的测量
定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，两者间的共价键几解离而释放出活性分子，这一光解作用称为解笼锁。
笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁的第二信使、笼锁钙等
十．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。
能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移。
荧光能量共振转移的条件
两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm，供体的发射波长与受体的激发波长一致
检测：
以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
应用：检测大分子的相互作用
大分子构象的改变(蛋白)，例：大分子(亚基)的结合与分离
受体与配体的结合 ，常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
十一 .其它应用
生物材料,例: 细胞在生物材料中的生长状态及分布
激光扫描共焦显微镜的发展趋势：
连续光谱型Confocal
多光子激光扫描显微镜
