ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量
实验概要
本法是用纯化或重组的IL-2R(α链,P55,CD25,Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板,同时加入已知量的抗IL-2RMcAb,再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照,从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。
主要试剂
1. FITC标记的抗IL-2R McAb(0.2μg/ml):FITC为异硫氰酸荧光素,这里仅作为半抗原使用,而不作为荧光素标记。
2. 碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体(酶标抗体)
3. 对硝基苯磷酶盐底物液;用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解,配成浓度为1mg/ml。
4. 1%牛血清白蛋白-PBS(1%BSA-PBS):为封闭液点稀释液
5. 不同倍比稀释度的sIL-2R标准品:以1% BSA-PBS稀释。
6. 洗涤液(0.05%Tween20-PBS)
主要设备
96孔酶标板(聚苯乙烯板),酶标仪,波长465nm滤光片,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头),4℃冰箱
实验材料
1. 纯化或重组的IL-2R蛋白(α链,P55,CD25,Tac抗原)(40.000u/ml)
2. 待测sIL-2R样品
实验步骤
1. 以一定浓度的纯化或重组的IL-2R(P55)蛋白包被96孔酶标板,100ul/孔,4℃过夜(16-72h);
2. 弃包被液,用1%BSA-PBS封闭非特异性结合位点,200ul/孔,置室温2h;
3. 用洗涤液加满各孔置3min,然后倾去,反复洗涤3次;
4. 分别加入不同稀释度的sIL-2R标准品及待测样品,50μl/孔;
5. 各孔均加入FITC标记的IL-2R McAb,50μl/孔,充分混匀后置室温2h;
6. 同上洗涤3次;
7. 各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗FITC抗体,100μl/孔,置室温1h;
8. 同上洗涤3次;
9. 各孔均加入底物液,100μl/孔,置室温15-30min;
10. 用酶标仪以波长405nm测各孔OD值。