同位素分析法诠释苯的微生物降解
苯，是存在于自然界中最简单的芳香类化合物，也是一种致癌物质。被苯污染的地下水可能会带来多种风险，所以探明苯的生物降解过程对于风险的评估和控制是非常有意义的。
有氧状态下，微生物可以很快的把苯分解掉。深层地下水中溶解的氧气会由于苯的降解而被消耗殆尽，导致深层地下水的缺氧状态。但在无氧条件下，苯因具有反应惰性而保持性质稳定。即使过程缓慢，我们仍能观察到由厌氧性微生物引起的苯的降解过程。关于这类微生物的属性，以及其在无氧状态下与苯进行新陈代谢的方式，大约20年前人们还对此一无所知。在德国莱比锡西南约50公里的小城采兹(ZEITZ) 附近曾有一个曾经用于氢化和苯的制造厂，地下水管道因二战时被苯污染过，近年来被当成此类研究的宝地。借助于稳定同位素分析法(缩写CSIA)，海姆霍兹环保中心的科学家们现已能够对缺氧性地下水中的苯的降解过程进行监测。
使用同位素比质谱仪(IRMS)准确地测定了在不同的地下水样品中重的与轻的苯分子的比例，进而发现当样品中所含的苯越少，则其苯分子中氘同位素就富集得越多。CSIA是非常简捷的方法，仅需做少量的分析就能验证微生物降解苯的过程。但此法尚不能辨別微生物的种类，鉴定微生物需要进行实验室培养。将来自采兹地下的微生物定植到一定的表面上，能很好地使苯降解。借助于充填了沙粒或火山石碎粒，且用含苯的地下水淋洗过的柱子装置，可以在现场对厌氧性微生物降解剂进行富集。通过生化反应的呼吸作用，苯在柱中被硫酸盐消耗掉并矿化成CO2。这种起定植作用的沙粒成为厌氧性细菌实验室研究的新起点。
图1.装满了沙粒的渗滤柱装置。黑色是硫化铁影响，还原硫酸盐的过程中沉积到了沙粒上。
多种微生物参与苯的降解
对沙粒上微生物进行分子分析表明有多种微生物参与了苯的降解。最先向苯分子发动进攻的假设是未被人工培养、与发酵菌同类的微生物(Cryptanaerobacter/Pelotomaculum)——这一假想得到DNA-稳定性同位素核酸探针技术的支持。对13C标记的苯进行抑制实验也表明，苯的降解过程中，有氢气和醋酸盐的产生和消耗，两者均为互养型微生物群体的典型代谢产物。
苯的降解过程为：发酵性微生物袭击苯分子并利用苯分子的碳来助生长，还将氢气和醋酸盐提供给硫酸盐还原菌助其生长, 从热力学角度上促进了发酵的进行。极小部分的醋酸盐转化为甲烷。但硫酸盐还原菌利用苯中的碳来助生长，此推测DNA-SIP尚不能证实，或因该方法不够灵敏，也或者硫酸盐还原菌的碳需求不是由醋酸盐提供的。
蛋白质-SIP提供更重要信息
稳定同位素标记(SIP)实验中得到答案。蛋白-SIP实验的核心是肽的质谱分析。先对肽进行识别,然后定量分析重的、富集了13C的肽，不同标记的肽链可以被区分开来，可以精确测定重同位素在肽链中的分布。使用蛋白-SIP法可以比其它的SIP方法更详细地分析化合物在微生物群落中的代谢过程。
图2.肽链的质谱图:随时间增多的13C被掺入到肽链上。该同位素向质量增大的方向移动(测量起点和终点分别是黑色、红色同位素)。
在本研究中，借助于预先建立的强大基因组数据库，已将苯降解微生物群体中超过600个蛋白质进行了识别，并对其官能团进行了鉴定。通过精确计算标记碳的数量及其随时间的变化，不仅证实了上述推测，还发现了微生物群中摄取苯中碳新细菌。在实验室条件下发酵剂吸收50%苯中的碳，并固定50%CO2中的碳。通过13C的掺入模式：实验初期13C标记的高浓度，证明了发酵剂对苯的直接回收。硫酸盐还原菌的肽链的标记模式表明，这些细菌不直接将苯代谢为其生长所需的碳，而是吸收发酵剂的代谢产物并固定CO2中的碳。此外，检测到的第三类微生物，其蛋白质中仅仅掺入了少量标记碳。这种微生物对苯的降解所起的作用, 以及摄取碳的来源，尚未结论。
高灵敏度可致更广泛的应用
把稳定同位素标记法测定的高灵敏度和蛋白质官能团的分类鉴定结合联用就是蛋白质-SIP法。该方法的高灵敏度还可测定标记不完整底物。这就使我们对分子结构单元(某些官能团)在微生物群中特殊的代谢过程进行研究成为可能。所以，蛋白质-SIP方法将会得到更多的应用，目前的研究预示了其良好的发展前景。
苯的互养厌氧降解模型如图3所示。发酵菌将苯发酵成氢和醋酸盐。硫酸盐还原菌(图中简化表示为一个单一有机体)和发酵菌将外部环境中的CO2固定。但发酵菌单独存在时则不能降解苯。少量苯被转化为甲烷(在图中未显示)。由苯产生出来的物质被标为红色。
图3.苯的互养厌氧降解示意图。
降解苯的微生物群之间如何相互作用尚未结论。在沙粒上生长的事实表明：该微生物细胞需相互靠近并交换代谢产物，地下水层符合此条件。99%以上微生物以聚居在沉积物表面，形成生物膜，小部分存在于地下水中。因此，实验室研究可以直接转移到被污染的地下水层，使厌氧降解苯在现场得以实现。
稳定同位素技术(SIP)
有不同中子数的同一元素的不同核素互为同位素。稳定的同位素是理想的生物标志物，它们质量不同，而其化学性质基本相同。稳定同位素技术(SIP)是掲示复杂生物中养分流的新有效方法。SIP实验中，使用富集了稳定同位素13C或15N的底物，对掺在生物分子内的同位素进行检测。生物分子可以是磷脂脂肪酸(PLFA-SIP)、脱氧核糖核酸(DNA- SIP)、核糖核酸(RNA- SIP)或蛋白质(蛋白质-SIP)。
