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优化样品前处理实现草本茶中农药残留的LC/MS/MS分析

2020.3.04

采用预称量的试剂盒优化QuEChERS方法，实现快速简便的方法开发。该法可以充分净化高度着色的样品，大多数农药的回收率高，重现性好，平面结构农药没有明显的保留损失。

草本茶已深深融入到多种文化中，通常被认为能够改善身体健康状况，降低各种疾病的发生，例如癌症、中风和骨质疏松症等。对茶的高需求量，要求实施现代化的农业生产方式，包括施用农药来维持茶收成的稳定。无论是允许还是禁止使用的农药，其最大残留限量越来越低，因此对草药制品中颇多种类农药的检测就需要快速、稳定且高效的方法。该方法中至关重要的一步就是样品前处理，尤其针对植物性基质，它们往往非常复杂，且包含有干扰的基质化合物，导致离子抑制、共流出和仪器污染。

本研究采用快速、简便、经济、高效、耐用且安全的称之为QuEChERS 的技术完成草本红茶和绿茶样品的前处理。QuEChERS 包括如下三个简便的步骤：1) 采用有机溶剂和分配剂盐进行萃取;2) 采用吸附材料(分散吸附剂)进行样品净化;3) 液相色谱或气相色谱分析，或两者均采用[4,5]。分散净化吸附剂包括C18、N-丙基乙二胺(PSA) 和石墨化碳黑(GCB)。对于包含大量色素的茶样品，GCB 的使用越来越重要;但必须谨慎使用，因为它也会移除目标分析物，尤其是具有平面结构的化合物。

实验条件

仪器条件

液相色谱：Agilent 1290Infinity液相色谱仪 Agilent6410三重四级杆液质联用系统;质谱离子源参数：色谱柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18,2.1×150mm，1.8μm;洗脱液：A:水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸;进样量：10μl;0.2ml/min;柱温：22℃;模式：ESI⁺;干燥气温度：300℃;干燥气流速：7L/min;雾化器压力：35psi;毛细管电压：3500V。

梯度程序：

时间（min）	%B
0.0	5
0.5	5
5.0	60
7.0	80
12	95
15	95

材料

HPLC 级乙腈(Honeywell International, Inc);反渗透水采用Millipore水纯化系统制备。甲酸(98%)(ACS级，Sigma-Aldrich 公司);茶样品来自多家供应商;标样(Accustandards公司);为浓度100µg/mL的乙腈溶液。将它们混合并用乙腈稀释到适当浓度，储存在冷冻箱(–3ºC) 内。

实验分析

样品前处理

萃取：适用于10g样品的Agilent Bond Elut QuEChERS Original萃取管( 部件号5982-5550);分散SPE净化：Agilent Bond Elut QuEChERS分散通用试剂盒，15ml分散SPE管(400 mg PSA，400mg C₁₈，45mg GCB，1200mg MgSO₄)(部件号5982-0029);过滤：Captiva Premium注射式过滤器，尼龙膜，15mm，0.2µm(部件号5190-5088)

QuEChERS 萃取

称取干茶叶1±0.01g，置50 mL离心管中，按照要求给样品加标。于离心管中加水10ml，加盖并涡旋1 min。样品彻底润湿后，将浓度50 ng/mL的内标(乐果-d6、敌草隆-d6和二嗪农-d10)乙腈溶液(10 ml) 加入离心管中，加盖，手动振摇1 min，然后置超声水浴中超声15 min。取出离心管，加入Bond Elut QuEChERSOriginal萃取盐(4g MgSO₄，1g NaCl)，然后将离心管手动强力振摇1 min。随后将样品以4000 rpm的转速离心5 min，实现水相和有机相溶剂的分离(图1，步骤1)。

分散固相萃取

离心后，将6 ml上层乙腈溶液转移到Bond Elut QuEChERS分散通用试剂盒的15 ml离心管中。将离心管涡旋1 min，然后以4000 rpm的转速离心3 min。离心后，取2 ml净化的萃取液加入10ml试管中，氮气流吹至近干。采用0.7ml H₂O + 0.1%甲酸(FA) 混合溶剂、0.2ml乙腈，以及0.1ml乙腈或校准标准液复溶样品。接着，将样品注射式过滤至自动进样器样品瓶中，用于LC/MS/MS分析(图1，步骤2)。

校准曲线和线性

通过混合安瓿中的认证标准液来制备储备标准液。将储备标准液用乙腈适当稀释来制备工作标准液。溶剂复溶时，将适量的工作标准液加入经QuEChERS萃取的空白绿茶和红茶样品中，制备基质匹配的标样，浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100 和200ng/mL。将三种内标加入所有样品，浓度50ng/mL，并采用完整QuEChERS工作流程进行萃取。通过这些标样得到线性校准曲线，R2不小于0.992(数据未显示)。

结果与讨论

QuEChERS萃取盐和净化试剂盒的选择

为了实现最高的回收率和重现性，本研究评价了几种萃取盐试剂盒。在测试了Bond Elut QuEChERS Original、AOAC 2007.01和EN15662萃取盐后，我们发现包含1g NaCl和4 g MgSO₄的原萃取试剂盒可获得总体上最高的回收率。由于大量色素会与目标分析物一同萃取出来，因此，选择包含GCB的分散净化试剂盒是非常必要的。我们发现，使用包含PSA、C₁₈、GCB和MgSO₄的Bond Elut QuEChERS通用试剂盒，可以获得明显更洁净的样品，以及更高的回收率，并且仅极小到中等程度地保留平面结构农药(多菌灵、噻菌灵、三环唑和嘧霉胺)。

回收率与重现性

对于绿茶和红茶基质中的176种农药，绝大多数使用本方法均可获得优异的回收率和重现性。对于绿茶样品，浓度10 ppb 82%农药的回收率和浓度100 ppb 92%农药的回收率，均在70 - 120%范围内。对于红茶样品，浓度10 ppb 76%农药的回收率和浓度100 ppb88%农药的回收率均在70 - 120%范围内。如图3所示，还有较少农药的回收率低于50%并且有一些农药未能检出。

小结

本文优化了QuEChERS样品前处理方法，实现对草本绿茶和红茶中176 种农药LC/MS/MS 分析。在UPLC/MS/MS平台上，该方法可以实现快速分离和高灵敏度检测。样品前处理可以充分净化高度着色的茶样品，并且大多数农药均可获得高回收率。

尽管LC/MS/MS是农药残留分析的一款强大工具，但它并不适合分析适用于GC分析的某些类农药。将来的研究将探讨采用GC/MS/MS优化分析干燥植物基质中的农药。这些适用于GC 分析的农药中，有一些可以被GCB吸附剂所保留，因此，必须小心权衡样品的净化与色素的清除，确保分析物达到一定的回收率。LC和GC工作流程的结合，将为绿茶和红茶中农药分析提供完整的解决方案，并且提供了可以进一步转换为分析其他高度复杂干植物基质的方法学。

样品前处理

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优化样品前处理实现草本茶中农药残留的LC/MS/MS分析

周锦帆