免疫组化抗体选择要点及流式抗体选择常识
一抗的选择要点
1.选择单克隆还是多克隆抗体？由一种B细胞产生的单一特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种B细胞产生抗体，形成抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小、检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱、抗体的亲和力强、灵敏度高，但易出现非特异性染色（实验时可以通过封闭等尽量避免非特异性染色）。
2.抗体的种属来源。一般兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有例外。抗体的来源这点非常重要，后面检测时带标记的二抗必须与一抗来源相匹配。
3.实验目的是检测什么种属的抗原，即Species Reactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Mouse、大鼠Rat、人Human等等，选购时尽量选择说明书上已经标注反应性的抗体。
4.能否做免疫组化？一般一抗说明书都会注明是否能做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过实验验证的。
5.检测标本类型。用户是检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，都可以用来检测冰冻切片；但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。
6.价格与质量。进口抗体时间长，且价格高，很多都是国内厂家OEM的，科研型的抗体属于浓缩型抗体，需要多摸索几次实验条件，建立合适的实验条件后再进行大批量的实验，并且实验操作者的熟练程度、对实验的把控等对实验结果影响也很大，实验细节一定要把控好。另外，抗体切记避免反复冻融。
二抗的选择
1.种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（二抗来源goat or Rabbit均可）；如一抗是兔来源，那二抗就买抗兔的即可。
2.标记物的选择。常见的标记物有HRP、Biotin、荧光素等。免疫组化现阶段多用二步法，二步法使用的二抗通常是带多聚HRP标记的，普通的HRP标记应用到免疫组化效果会比较差；前几年应用比较多的三步法，二抗上带Biotin标记，然后加入HRP标记的链霉素进一步反应。而免疫荧光染色就需要购买荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。如何选择二抗主要看实验应用是免疫组化还是免疫荧光。
3.选择IgM还是IgG。二抗需与一抗的类别或亚型相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体
单克隆抗体的类别及亚型通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚型（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚型的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。如果你不知道一抗是哪一类别或亚型，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。
流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此选购流式抗体时需要综合考虑各种影响抗体品质及检测效果的因素，例如抗体的特异性、荧光素信号的强弱、荧光素标记的方式、同型对照等等。
如何选择合适的流式抗体？
1.流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体首先要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白识别特异性、反应种属以及应用实验；
2.流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，遵循尽量减少实验工序和过程以保证实验的真实性和准确性，因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验；
3.流式抗体荧光标记的选择：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同，以FACS
Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原；FITC强度较弱，适用于强表达抗原并且使用范围比较广泛。如果实验中检测单一指标，用户可根据检测的目标蛋白表达丰度进行选择同时可兼顾标记抗体的价格等综合因素；如果同时检测多个指标，用户先需要确认流式细胞仪能检测多少个通道-------流式抗体每个通道只能选择1种荧光素，各个通道之间的荧光素可以随意搭配，比如实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，例如FITC、PE和PE-Cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后的实验结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本可同时做的表面/胞内标志就越多。常用的荧光标记包括FITC,
PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5, APC等。
同型对照的选择
流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源、同亚型、同荧光标记的抗体。例如抗人的CD3的PE标记的抗体，如果抗体来源于小鼠、亚型为IgG2a的话，就必须选择PE标记的小鼠的IgG2a作为同型对照。
流式抗体使用注意事项
1.建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能影响到实验结果，因此建议实验前先优化一下试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10
μL，而微流式细胞术则只需5×105个细胞，抗体用量相应的可减少到5 μL。
2.带荧光素标记的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。
相关参考
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）：是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球、细菌、小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞术产生于上世纪六七十年代，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是非常先进的细胞定量分析技术。该技术被广泛的应用于细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等多个领域，如细胞周期、细胞凋亡、细胞活力的检测、淋巴细胞亚群与疾病的关系研究、器官移植后的免疫学监测、肿瘤的特异性指标的检测、药物作用机制研究、筛选新药等等。
