毛细管电泳的应用前景（二）
4. 毛细管等电聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使各种具有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置,形成窄的聚焦区带.已成功地用于测定蛋白质等电点,分离<BR>异构体等.如用CZE和CIEF研究制备过程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>结果表明CIEF方法要比CZE的好[17].
5.
毛细管等速电泳(capillary
isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先导电解质和尾随电解质.使溶质按其电泳淌度不同得以分离,是一种较老的方式.现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品,以解决CE测定中浓度灵敏度不如服比的问题,如HPLC的问题,如在线ITP—CZE即是成功的模式[18].
6. 毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)
将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中(或涂渍到管壁).以样品与固定相之间的相互作用为分离机制,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程称为CEC[19-20].
CEC将CE的高效和HPLC的高选择性相结合,得到了CE研究者的青睐.90年代初解决了毛细管填充技术后,CEC发展迅速,HPCE'97会议上已达35篇论文,HPCE'98又创54篇之多.CEC可分为开管CEC(即管壁涂渍固定相)和填充CEC.我国学者在CEC方面作了大量研究工作,对CEC的理论,反相电色谱,正相电色谱,离子交换电色谱及电色谱手性分离等模式均作了较系统研究[21-23],连续两年在国际CE会上作大会报告,目前已在ODS,硅胶,氰基,胺基,阴,阳离子交换树脂等10余种填料CEC柱上进行研究,开管CEC也发展了一些新技术,如硅胶—溶胶法在管壁涂渍C8固定相[24],分子印刷法分离手性化合物[25].
以上六种模式为CE基本模式,此外如亲和,免疫毛细管电泳发展趋势亦较好.
四,毛细管电泳柱技术
毛细管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛细管直径,长度,形状和材料方面,目前集中在管壁的改性和各种柱的制备.
动态修饰毛细管内壁
管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流,通常采用动态修饰和表面涂层两类方法.动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂,如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB),能在内壁形成物理吸附层,使EOF反向.添加剂还有聚胺,聚乙烯亚胺(PEI)等,甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层.
2. 毛细管内壁表面涂层
涂层方法有很多种,包括物理涂布,化学键合及交联等
最常用的方法是采用双官能团的偶联剂,如各种有机硅烷,第一个官能团(如甲氧基)与管壁上的游离羟基进行反应,使其与管壁进行共价结合,再用第二个官能团(如乙烯基)与涂渍物(如聚丙烯酰胺)进行反应,形成一稳定的涂层.此外还有将纤维素,PEI和聚醚组成多层涂层,亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层[6].
3. 凝胶柱和无胶筛分
CGE的关键是毛细管凝胶柱的制备,常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行DNA片段分析和测序.测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-LPAGE).如将聚丙烯配胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)浓度降为零,得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分离的作用,称无胶筛分.此法简单,使用方便,分离能力比CGE差.
4. 毛细曾填充往等
CEC填充柱已在前面论述.也有将核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脱氨酶等固定到毛细管表面,构成一开管反应器,再和CE连接,可进行核酸选择性检测,微量在线合成和分离寡核昔酸等工作.另一有意义的工作是用各种方式在毛细管内缓冲液中形成各种梯度,如PH梯度,溶剂浓度梯度等,来提高分离效率和选择性.
五, 毛细管电泳检测技术
CE对检测器灵敏度要求相当高,故检测是CE中的关键问题.迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末用于CE外,其它检测手段均已用于CE.现选择重要的几类检测器介绍其最新进展.
紫外检测器(UV)
UV检测器集中在提高灵敏度,如采用平面积分检测池,这种设计可使检测光路增加到1cm[26].也有用光散射二极管(LEDS)作光源,其线性范围和信噪比优于汞灯.总体来说进展不大.
2. 激光诱导荧光检测[LIF]
LIF是CE最灵敏的检测器之一,极大地拓展了CE的应用,DNA测序就须用LIF,单细胞和单分子检测也离不开LIF.LIF不但提高了灵敏度,也可增加选择性,缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色.利用CE-LIF技术可检出染色的单个DNA分子,向癌症的早期诊断及临床酶和免疫学检测等方向进行.CE/LIF向三个方向发展:在原有氦—镉激光器(325nm)和氩离子激光器(488nm)之外,发展价廉,长波长的二极管激光器;发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面;开展更多的应用研究.CE/I'IF和微透析结合可测定脑中神经肽.采用波长分辨荧光检测器可提供有关蛋白和DNA序列的一些结构和动态信息[27].一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如CY—5等,正在不断开发和应用.
3. CE/MS联用
将现在最有力的分离手段CE和能提供组分结构信息的质谱联用,弥补了CE定性鉴定的不足,故发展特别快.CE/MS联用主要在两方面发展:一是各种CE模式和MS联用,二是CE和各种MS联用.关键是解决接口装置.成功地应用到CE/MS接口中.
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