知识分享：基因定点突变
实验原理
基因定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法改变目的基因的序列，包括碱基的插入、缺失、点突变等。基因定点突变是基因研究中比较常用的方法，可以短时间内研究目的DNA所表达的目的蛋白的性状及表征。
定点突变需要设计特定的突变引物。引物长度一般为25-45 bp，建议选择30-35bp长度的引物p。引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求引物两边都能与模板搭上，所以引物的两边各设至少12个bp。以要突变的位点碱基为中心，加上两边11-12 bp的序列。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败。同时需要设计一条反向互补的引物。为保证PCR反应正常进行，引物设计完成后需计算Tm值，若Tm值不合适，可以适量调整引物长度。
实验材料
PCR引物，质粒或者基因组模板，PCR Buffer，PCR用高保真酶，ddH2O。
实验过程
1、PCR扩增
30 μL PCR（phusion）体系如下：
成分
体积（ul）
水
18.2
Buffer
6
DMSO
0.9
dNTP
0.6
酶
0.3
引物F+R
1.5+1.501
DNA模板
2、胶回收
第一轮PCR产物需要进行胶回收后再进行二轮PCR。
将第一轮PCR得到的条带进行切胶回收后，作为模板进行二轮PCR，二轮PCR的引物已第一轮PCR所用的两端引物。二轮PCR反应结束后需要进行纯化回收，为下一步的酶切做准备。
3、酶切
通过酶切回收目的基因片段、载体时，避开基因中的酶切位点，选择合适限制性内切酶。当酶切回收目的基因时要注意目的基因装在PENTER载体的位置。用限制性内切酶处理目的载体时，要将载体片段的量控制在2μg以内，并在酶切反应后进行去磷酸化处理。
30μL酶切体系
成分
体积（ul）
载体DNA
1-2ug
10X Buffer
1
E1
0.8
E2
0.8
水
补足30ul
4、连接
根据片段的大小以及基因的亮度来调节片段连接的比例，一般亚克隆的连接体系如下
成分
体积（ul）
载体DNA
2
目的基因
6
T4连接酶
1
T4 Buffer
1
将连接产物放于22℃保持1~2h。
5、转化
（1）冰上融化感受态DH5a,，加1ug/ul的质粒1ul于10ul感受态中，冰上放置30min。
（2）42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰上2min-5mins。
（3）超净台内向各管含质粒的感受态中加入500ul-1ml高压过的LB培养基，37℃，低速培养1h。
（4）取100ul转化菌涂板，至菌液快干时，倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时，次日观察菌落生长情况。
6、获取正确质粒
（1）挑取转化子
挑去大肠杆菌转化子至正确的抗性培养基中（KANA、AMP）,并对HM号及孔号做好记录。
（2）酶切验证
将提取好的质粒用合适的限制性内切酶进行酶切验证。
10μL酶切验证体系：
成分
体积（ul）
质粒DNA
3
10X Buffer
1
E1
0.25
E2
0.25
水
5.5
37℃保持30min~1h后进行琼脂糖凝胶电泳。
（3）测序
将酶切验证正确的样品送至测序公司进行测序，并做好记录。
注意事项
1、引物设计时须参照引物设计原则，注意引物中的GC含量，引物长度等，可在引物的两端选择G或者C，可以提高引物和模板结合的概率。
2、PCR过程中未得到相应大小条带或条带不单一，应适当调整退火温度，已调整聚合酶和引物的特异性。
3、使用一轮PCR产物进行第二轮PCR时，需等量加入作为模板的PCR产物的mol量。
4、某些特殊的限制性酶切酶处理基因时需要进行65℃灭酶处理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使内切酶变性和DNA分离。
5、连接后转化，注意载体中的抗性基因，可以设置空白对照，已转化后得到的单菌落数量评估获取阳性克隆的概率。
6、酶切验证后，正确克隆须送测序验证，使用软件比对序列的碱基是否已经完成突变。
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