菌种的诱导培养及蛋白的提取

2019.4.20

实验概要

本实验通过摇瓶培养和发酵罐培养分别小量和大量诱导菌种表达，获得了目的蛋白的粗提物，通过Amylose亲和层析获得纯化蛋白。

主要试剂

LB培养基，2-YT培养基，诱导剂IPTG，5N氢氧化钠，2N盐酸，葡萄糖

主要设备

恒温振荡器，离心机，发酵罐

实验材料

重组菌

实验步骤

1. 摇瓶培养

1) 取出4℃下平板保藏的菌种，挑取单菌落，接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中，37℃,300r/min,恒温振荡培养,过夜活化;

2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养，作为2L摇瓶培养的菌种。

3) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含400m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的2L的摇瓶中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。

起始诱导时机为菌体OD₆₀₀=4，诱导剂IPTG (IPTG贮液:浓度为20%, 0.22um膜过滤除菌，分装后-20℃冻存。)浓度为0.03 mmol/L，诱导表达的时间控制在4h左右。

2. 5L发酵罐培养

1) 取出4℃下平板保藏的菌种，挑取单菌落，接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。过夜活化;

2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100ml 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中，37℃, 300r/min,恒温振荡培养，作为5L发酵罐的菌种。

在基因工程菌株5L高密度发酵过程中，温度由系统自动控制在37℃，通过自动流加5N氢氧化钠和2N的盐酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采用恒速流加，即培养5h后开时流加补料，以0.042g. (L. min)^-1葡萄糖的的速率进行补料。发酵的IPTG诱导时机均为OD₆₀₀约为3时进行诱导，IPTG的浓度为0.1 mg/ml。

3. 目的蛋白粗提物的获得

1) 试剂配制

CB(Column Buffer)缓冲液:

Tris-HCl 20mmol/L(pH 7.4)

NaCI 200mmol/L

ED TA 1 mmol/L

PH 7.4

称11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl，用NaOH调至PH7.4，加超纯水至1L，用0.22um滤膜滤菌。

2) 提取方法

发酵液以8 000r/min离心30min收集菌体。菌体收集后用无菌水洗二遍，以洗去表面残留的培养基。按1:10的比例(W/V)把菌体悬浮在CB溶液中，超声波破碎细胞，功率40W，每破碎l0s后间隔2s，每5min取样，用Bradford法测定可溶性蛋白总量，确定最佳破碎时间。破碎过程中保持低温(0℃)，完全破碎后于4℃以10 000 r/min离心30min，上清液用于上柱纯化。

4. Amylose亲和层析

1) 试剂配制

a. CB(Column Buffer)缓冲液同上

b. CB加麦芽糖(10mmol/L ):称取3.6g麦芽糖，用CB配成1L溶液，用0.22um滤膜滤菌;

c. 0.1%SDS:称1g SDS，加超纯水至1L，用0.22um滤膜滤菌。

2) 层析步骤

a.柱子的清洗:先用20%酒精润洗柱子2次，装柱;

b.柱子的平衡:新柱料用5倍体积的CB洗柱，再生柱料用3倍体积的CB平衡，流速为2m1/min;

c. 上样:流速为0.5ml/min;

d. 洗杂:用CB洗柱至流出液的A值与空白(即CB)相同，流速为2ml/min;

e. 洗脱:用CB加麦芽糖洗脱，流速为0.5ml/min，分步收集产品进行SDS-PAGE分析，确定最佳洗脱条件;将接下的样品取一小样，留做检；

f. 柱料的再生:依次用3倍柱体积的无菌水、3倍柱体积的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱体积的无菌水洗柱，各步均须洗至基线;再用3倍柱体积的CB平衡柱料;