哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定
哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定实验
| 实验方法原理 |
萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。 荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA 转染的哺乳动物培养细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 细胞裂解缓冲液 荧光素酶测定缓冲液 荧光素溶液 不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 荧光光度计和光度计测置管 橡胶棒 |
| 实验步骤 |
1. 转染后 24-72 h, 室温下用不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液（PBS） 洗细胞 3 次。PBS 换液时要轻缓，因为有些哺乳动物细胞（如人胎肾 293 细胞）在剧烈吹打时很容易从培养皿上脱落下来。通常，荧光素酶基因在转染细胞中获得最大表达量的时间是 24-72 h。 2. 每个 100 mm 培养皿中的转染细胞，加入 lml 冰冷的裂解缓冲液。缓冲液轻轻旋转， 然后用橡胶棒把裂解细胞从培养皿上刮下来。细胞裂解物转移到 1.5 ml 离心管中。 3. 细胞裂解物在 4°C 以最大速度离心 5 min。把上清小心地转移到另一个新的 1.5 ml 离心管中。 4. 用 Bradford 测定等快速比色法确定裂解物的蛋白浓度。在测定蛋白浓度前，为了防止干扰，把 TritonX-100 的浓度稀释到小于等于 0.1%。这步中，细胞裂解液可以分成小份， 贮存在-70°C。虽然贮存在或-20°C 时，荧光素酶在裂解缓冲液中不稳定（Brasier et al.1989）， 但是在含 15%（V/V）甘油和 1%（m/V） 牛血淸白蛋白的缓冲液中，该酶可以在 4°C 安全贮存。 5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁，轻轻使裂解物混合。室温下，在每个含有 360ul 荧光素酶测定缓冲液的荧光光度计管中加入 5-200ul 细胞裂解液。管子放入荧光光度计。 除了可使用荧光光度计测量荧光素酶活性，还有另一种方法在栏目替代方案：用闪烁计数器测量荧光素酶活性。 6. 测定开始，200ul 荧光素溶液加到荧光光度计管中，然后在室温测量 2-60s 时间内的光输出。測光输出时间的最佳长短要根据经验确定，而且与转染细胞的类型以及所用的特殊底物和荧光素酶有关。 7. 测定每个管子产生的相对光单位数，并确定测量的线性范围。使用适当量的细胞裂解蛋白，使它在随后测量中产生的值位于线性范围的中部。根据所研究启动子的强度以及每次实验的转染效率，所需蛋白的量会有变化。细胞裂解物中荧光素酶活性可以用相对光单位数或毫克表示。
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| 注意事项 |
荧光素是能够受荧光素酶催化发光的底物的通称。常用的荧光素酶基因来自萤火虫，它作用于特定的荧光素底物。其他如来自海三色堇或某种海洋细菌的荧光素酶所使用的荧光素底物具有不同的化学性质。确定前面缓冲液中所用的荧光素底物确实与表达质粒中的荧光素酶基因相匹配。
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| 其他 |
为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有荧光素酶基因的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo
Reagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。 展开 |
