| 实验步骤 |
一、材料与设备
1. 寡核苷酸。
2. 乙腈。
3. 混合液 A：0.5 mmol AMP（5' 磷酸化）溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
4. 混合液 B：1 mmol 三苯磷，1 mmol 2，2'- 双吡啶二硫化物，2.5 mmol 咪唑，0.90 ml 三乙胺，溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。
5. 沉淀液：9 mmol NaClO4，225 ml 丙酮，115 ml 乙醚 ( 无水乙醚)。
6. 25 mmol MgCl2。
7. 50 mmol/L ImpA ( ImpA 合成见操作方法第2部分）。
8. 0.2 mmol/L p17.91X ( 见操作方法第1部分，即 3' 末端封闭的 3' 端供体寡核苷酸）。
9. 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mmol/L EDTA。
10. 乙醇。
11. DEPC。
12. 糖原。
13. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Hepes ( pH 8.3 )，50 mmol/L MgCl2， 16.5 mmnol/L DTT，30 μg/ml BSA，41.5% 甘油。
14. T4 RNA 连接酶。
15. 反转录酶（invitrogen superscript RT）。
16. 重蒸水。
17. 10X dNTP( 1X dNTP 含有每种 dNTP 各 0.2 mmol/L）。
18. 100 mmol/L DTT。
19. 0.1 mol/L EDTA。
20. 1 mol/L KOH。
21. 1 mol/L Tris-HCl ( pH 1.0 )。
22. 0.2 mol/L MgCl2。
23. T4 DNA 连接酶。
24. 5X T4 RNA 连接酶缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，125 μg/ml BSA。
25. BanⅠ限制性内切核酸酶。
26. 10X NEB 缓冲液 4：500 mmol/L 乙酸钾，200 mmol/L Tris-HAc，100 mmol/L 乙酸镁，10 mmoI/L DTT。
27. 溶胶溶液：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0。
28. TOPO TA 克隆试剂盒。
29. Taq 酶。
30. M13F 引物：5' GGTAACGCCAGGGTTTTCC 3'。
31. M13R 引物：5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'。
32. 1X 上样液：8 mol/L 尿素，0.5 mol/L EDTA。
二、操作方法
1. 寡核苷酸设计
(1) 用于 RNA 克隆的寡核苷酸（下划线部分为 BanⅠ酶切位点 G↓GYRCC）：
3' 端供体寡核苷酸：17, 91-pCTGTAGGCACCTCAAx（x：DMT-O-C3-CPG）。
5' 端受体寡核苷酸：17.93R ATCGTaggcacctgaaa（小写部分为 RNA，大写部分为 DNA）。
3' 端反转录引物：15.22-ATTGATGGTGCCTAC。
5' 端 PCR 引物：17.93D-ATCGTAGGCACCTGAAA。
3' 端 PCR 引物：17.92-ATTGATGGTGCCTACAG。
(2) 18 和 24 碱基 RNA Marker 转录序列：
T7 启动子可转录 24 个碱基的序列（斜体是 T7 启动子）。
44.12D：TCACTATTGTTGAGAACGTTGGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC，从 44.12D 转录来的 RNA Marker（有 AclⅠ酶切位点）。
44.12R：GGCCAACGUUCUCAACAACAAUAGUGA。
从 Dharmacon 购买的 RNA Marker（含有 BamHⅠ酶切位点）。
18.113：AGCGUGUAGGGAUCCAAA。
2. ImpA 的合成
(1)
合成。合成 ImpA 的材料可从 Sigma 公司购买，要求纯度至少达到 99%，混合物 A 和混合物 B 用无水的烧杯盛装，将 A 缓慢地与
B 搅拌混合，开始时两种混合物不相溶，但当反应颜色转变为黄绿色的时候，固体物开始溶解，在烧杯底部出现的油状物最终也会溶解。室温搅拌 1~1.5
h。
(2) 纯化。一滴滴加入沉淀液，ImpA 开始析出，留 60 ml
液体供分析用。把沉淀转到离心管中，用丙酮洗余下的沉淀，5000 r/min 离心 10 min，倒出丙酮，用丙酮再洗 2
次。最后用乙醚洗，3000 g 离心 20 min，22.5~45℃ 之间真空干燥过夜，然后放在小瓶中 -20℃ 储存。
(3) 分析。称量合成物的重量。用 10 倍体积的饱和 (NH4)2SO4 预浸泡纤维素，然后干燥以进行纤维素薄层色谱分析。用水溶解
AMP 和 ImPA。分别将混合物 A、ImpA、混合物 B、纯化步骤中的留样液体、水溶解的 AMP 进行点样。用 80% 乙醇做展开液，展开
9 cm，AMP 最慢，ImpA 其次，混合物 B 和剩余物在最前端。用手提紫外灯观察。
3. 寡核苷酸的合成
所有的引物都用 Biosystems 公司的 8900 DNA 合成仪合成。
4. 放射性标记 RNA marker 的制备
体外转录 44.12D 获得 RNA Marker 44.12R。 用 32P 标记 RNA Marker 18.113 和 44.12R，再加 20％ 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，回收获得放射性标记的 18 和 24 碱基 RNA Marker（操作方法见相关章节）。
5. 寡核苷酸的腺苷酰化作用 1x 的合成
500 μl 反应体系中含 25 mmol MgCl2，50
mmol/L ImpA，0.2 mmol/L 17.91x。50℃ 孵育 3 h，20% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，胶厚度是 1.5
mm，上样孔为 23 mm 宽。电泳，切胶，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇 -20℃
沉淀至少一个小时，12000 g 离心 20 min，弃去上清，晾干沉淀，用蒸馏水溶解沉淀。得到的终产物 App 17.91x，可以在
-80°C 条件下保存数月。
6. 微 RNA 提纯
15% 变性聚丙烯酰胺胶，样孔宽 23 mm ,
先进行预电泳处理，然后把提取的总 RNA 和痕量的高灵敏放射性标记的 RNA marker（放射性标记的 18.113 和 44.12R）以及 1
倍体积的上样液混合，80℃ 加热 5
min，上样，电泳，直至指示剂染料电泳到电泳槽底部，把胶取下，放射自显影，将放射标记物之间的部分从胶上切下，用 0.3 mol/L NaCl
浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，离心后重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中。
7. 微 RNA 3' 端接头的连接
3' 端连接反应体系如下：5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.91x 2 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微 RNA、同位素标记的 RNA Marker 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应
2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。用 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用放射性标记 Marker，从胶上把 35~43
个碱基之间的部分切下，用 0.3 mol/L NaCl 浸泡过夜，再用 2 倍体积的乙醇沉淀，最后溶解于 10~20 μl DEPC
处理过的水中。
8. 微 RNA 5' 端接头的连接
5' 端连接反应体系如下： 5X RNA 连接缓冲液 2 μl，200 μmol/L App 17.93R 2 μl，4 mmol/L ATP 1 μl，T4 RNA 连接酶 1 μl，微RNA 3' 端连接反应产物 5 μl，总体积 10 μl。
室温反应 2~6 h 后用 10 μl 2X 上样液终止反应。与 3' 端纯化用相同的方法，最终获得 52~60 个碱基的混合物，重悬于 10~20 μl DEPC 处理过的水中保存。
9. 连接产物微 RNA 的 RT-PCR
反应体系如下：RNA 连接产物 5 μl，100 μmol/L 15.22 3 μl，dH2O 5 μl，
混合后，30°C 加热 2 min，然后继续加入：
5X 反转录缓冲液 5 μl，10X dNTP 7 μl，100 mmol/L DTT 3 μl，Superscript Ⅱ 反转录酶 3 μl。
在加入反转录酶之前，先在
48 ℃ 预热 3 min，从总体积中取出 2 μl 做对照。所有试剂都加完后，在 48℃ 孵育 1 h，然后加入 1 μl 0.1
mol/L EDTA 和 3.8 μl 1 mol/L KOH，90℃ 加热 10 min，除去所有 RNA，然后用 4 μl 1 mol/L
TriS-HCl pH 1.0 和 1 μl 0.2 mol/L MgCl2 中和反应。所有的RT反应产物都用于 PCR 扩增。
PCR 反应体系如下：反转录产物 5 μl，10X PCR 缓冲液 10 μl，10X dNTP 10 μl，100 μmol/L 17.92 1 μl，100 μmol/L 17.93D 1 μl，Taq 酶 2 μl，dH2O 71 μl，总体积 100 μl。
94°C 1 min，50°C 1 min，72℃ 1 min，扩增 20~25 个循环。
15%
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用 SYBR Gold ( 购于 Molecular Dynamics 公司） 染色。先用苯酚抽提 2
次，再用氯仿抽提 2 次，取水相，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，用乙醇沉淀 PCR 扩增产物，最后溶解到 40 μl 中水。
10. PCR 产物的连接
用 BanⅠ消化 PCR 产物，反应用酶及其缓冲液购自于纽英伦生物技术有限公司。反应体系如下：PCR 产物 40 μl，NE 缓冲4 30 μl，BanⅠ20 U/μl 10 μl，dH2O 220 μl，总体积 300 μl。
37°C
反应 4 h。取 15 μl 用 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，用 1 μl PCR 产物和 10 bp DNA ladder
做标准对照。用 SYBR Gold 染色。产物用酚和氯仿各抽提 2 次，加入 NaCl 至 0.3 mol/L，再用乙醇沉淀 BanⅠ消化的
PCR 产物。在沉淀中加入下列试剂，进行连接反应：H2O 8 μl，10X T4 DNA 连接酶缓冲液 1 μl，T4 DNA 连接酶 1 μl。
室温反应
30 min。琼脂糖电泳，用 100 bp DNA Marker 做标准。从胶上将大于 300 bp 的片段切下来，加 10
倍体积的溶胶液，65°C 放置 5 min，将融化的胶分到多个离心管中，加等体积的酚，振荡 20 s，冰浴 5 min，于 4℃ 5000 g
离心 10 min，移取水相，用苯酚：氯仿（1：1）混合物再抽提，最后用氯仿抽提。加 0.06 倍体积的 5 mol/L NaCl 和 2.5
倍体积的乙醇，-20℃ 沉淀 2 h 以上。
11. PCR 连接产物与 TOPO 载体的连接
将上步的沉淀溶解在以下的体系中：H2O 11.5 μl，10X PCR 缓冲液 1.5 μl，10X dNTP 1.5 μl，Taq 酶 0.5 μl。
72℃ 反应 5 min。取 5 μl 用于与 TOPO 载体连接。所有的连接产物都用于转化。在转化了的感受态菌中加 500 μl SOC 培养基，于 37℃ 培养 45 min，分別用 75 μl、150 μl、300 μl 涂氨芐抗性平板，37°C 生长过夜。
12. 筛选及测序
挑取白色克隆，划平板，生长过夜，用 PCR 筛选，PCR 反应体系如下：10X PCR 缓冲液 3 μl，10X dNTP 3 μl，100 μmol/L M13F 0.2 μl，100 μmol/L M13R 0.2 μl，Taq 酶 0.5 μl，dH2O 23 μl，总体积 30 μl。
94°C 3 min，94°C 40 s，50°C 40 s，72°C 40 s，进行 25 个循环。琼脂糖凝胶电泳检测，选择包含约为 500~800 bp 插入序列的克隆进行测序。采用生物信息学方法对序列进行分析。
展开 |
