miRNA影响椎间盘退变的机制研究进展
在当今社会，腰痛（LBP）患者数量庞大，LBP患者也因此饱受病痛折磨，椎间盘退变（IDD）作为LBP的最主要病因，其发病机制十分复杂，目前已知的就有基因、年龄和包括职业因素、吸烟、酗酒在内的一些不良生活习惯等因素。据统计，作为腰痛的主要病因的IDD疾病一年会给全球的经济造成超过700亿欧元的损失，并且IDD目前暂无较好的非手术治疗方法，这很大程度上与IDD具体机制不明，缺乏有效特异性靶点密切相关。随着近年来针对IDD发生机制研究的不断深入，发现退变相关基因在IDD进程中发挥了重要作用，但其之间的相互作用及异常表达机制仍不明确。而微小RNA（miRNA）作为基因表达的重要调控分子之一，被证明在多种疾病起始及进展阶段发挥关键作用，因此认为其可能在椎间盘退变中亦发挥重要作用。目前对于miRNA影响椎间盘退变的研究发现，多种miRNA主要通过作用于细胞凋亡、炎症信号反应、细胞外基质（ECM）成分等环节参与影响IDD的发生发展，笔者就此对miRNA影响椎间盘退变性疾病的研究进展综述如下。
椎间盘与椎间盘退变
椎间盘（IVD）是连接相邻两椎体之间的纤维软骨组织，IVD提供的稳定性对于整个脊柱的作用十分重要，IVD的中央部分是髓核（NP），形成IVD中的水凝胶样核。NP主要由蛋白聚糖和Ⅱ型胶原纤维组成，在每个IVD内其弹性功能可以分布在所有方向上的液压。髓核细胞主要有脊索细胞和成熟髓核细胞两种细胞类型。NP被纤维环（AF）所包围。AF是由Ⅰ型和Ⅱ型胶原纤维以及弹性蛋白纤维组成的同心排列的薄片，它们有助于承受压缩力并在受压过程中维持NP位置的稳定。最后，NP和AF像三明治一样夹在软骨终板（CEP）中间。CEP是透明软骨组织，将IVD与相邻的椎体连接，最终形成具有功能连续性的椎间关节。
在椎间盘退变过程中，椎间盘发生了复杂的生物化学以及分子水平的改变，这些改变包括蛋白聚糖含量的减少、Ⅱ型胶原向Ⅰ型胶原的转变以及NP细胞密度的降低等，这些改变直接导致IVD机械作用的降低并最终导致结构的破坏，比如纤维环破裂、NP细胞突出等。与导致细胞外基质分解因素形成鲜明对比的是刺激细胞外基质的合成因素，它们在再生过程中发挥了一定的作用。然而上述改变的具体分子机制仍不明确，导致相关非手术治疗研究受到极大限制。
miRNA的作用机理
miRNA作为短片段非编码RNA在2001年被正式认为是真核细胞中经典的基因调控者之一。miRNA是内源性的小RNA，通过作用于其他基因从而在细胞增殖、发生发展和新陈代谢中发挥了重要的作用。miRNA作为由18~22个核苷酸组成的非编码区单链RNA，由pri-miRNA转录而形成，普遍认为pri-miRNA有两种来源方式：（1）由特殊的miRNA编码的基因通过Ⅱ型RNA聚合酶转录而来，然后这些pri-miRNA在核内通过多蛋白共同作用而裂解，这些蛋白包含了一种锚蛋白DGCR8，能够促成大约70个核苷酸组成的pre-miRNA；（2）由mRNA内在的片段转录而来，而它们的成熟过程不需要Drosha/DGCR8的参与，这些miRNA由套索脱支酶（Ldbr）分离拼接而成，并与宿主蛋白质编码基因共同转录，形成发夹状pre-miRNA，这些内在的miRNA经常会和宿主蛋白质编码的基因出现在同一生物路径中。学者们研究发现，许多miRNA在退变椎间盘的髓核组织中表达出现显著异常，提示miRNA可能参与IDD的病理生理过程。
miRNA通过影响细胞凋亡参与IDD的发生 在细胞凋亡方面，Meng等的研究发现，在正常的髓核细胞中，抑制miR-125b-1-3p后，TSHZ3表达量增加，通过用H2O2进行DNA损伤，WesternBlot检测TSHZ3的表达，发现在DNA损伤的髓核细胞中，TSHZ3的表达量与DNA损伤程度相关。而TSHZ3是miR-125b-1-3p的靶基因，可能在椎间盘退变过程中发挥防御作用，而这种保护作用可被高水平的miR-125b-1-3p所抑制。Le等认为，在发育和应激反应过程中miR-125b是p53和p53诱导的细胞凋亡的直接负性调节剂。Zhou等认为，BAK1是miR-125b的直接基因，下调BAK1可以抑制紫杉醇诱导的细胞凋亡，并且会增加对紫杉醇的抵抗性。在miR-125b过表达的细胞中通过miR-125b抑制剂或者BAK1的再表达可以增加BAK1的表达以恢复紫杉醇的敏感性，对抗miR-125介导的紫杉醇抵抗性，并且发现在紫杉醇抵抗中miR-125b通过抑制BAK1的表达发挥了主要作用。
此外，Liu等通过收集193例退变的腰椎间盘髓核组织以及32例正常的腰椎间盘髓核组织，使用qRT-PCR检测miR-125a和BAK1的表达，用TUNEL染色和流式细胞术检测髓核组织的凋亡，用WesternBlot检测BAK1、Caspase-3、BAX和BCL-2的表达，认为BAK1是miRNA-125a的靶基因，miR-125a可能通过抑制其靶基因BAK1的表达而调节髓核细胞的凋亡状态，在IDD患者中随着BAK1的增加，而mIR-125a出现下降的趋势，BAK1mRNA与细胞凋亡呈现正相关，而miRN-125a与髓核细胞的凋亡呈现负相关。在体外转染miR-125a后，髓核细胞的凋亡出现减少，同时可以发现BAK1、Caspase-3、BAX的下降及BCL-2的上调。并且发现siBAK1可以逆转髓核细胞中miR-125a抑制剂的亲凋亡作用。因此miR-125可能主要通过多种途径影响髓核细胞的凋亡，可能是重要的抗凋亡靶点。
Liu等的研究发现，在通过压力诱导的髓核细胞凋亡中，miR-27a出现一个增高趋势，miR-27a通过直接作用于PIK3CD的3′-UTRs而抑制PIK3CD的表达并且促进髓核细胞的凋亡，过表达miR-27a后也能诱导髓核细胞的凋亡，所以认为PI3K是miR-27a的靶基因，上调的miR-27a通过作用于PI3K而促进人椎间盘细胞的凋亡，然而其在调控椎间盘髓核细胞凋亡中的重要性仍有待进一步研究。
Wang等通过RT-qPCR研究发现，miR-138-5p在退变的髓核组织中明显升高，在人的髓核细胞中应用miR-138-5p抑制剂后发现TNF-α介导的细胞凋亡被抑制，并且抑制了成熟caspase-3的表达，敲除miR-138-5p后，作用于其3′-UTR的SIRT1的表达增加，抑制miR-138-5p后，下调了PTEN蛋白的表达，并且提高了PI3K/AKT的活性。因此认为在椎间盘退变中，miR-138-5p通过PTEN/PI3K/AKT信号通路作用于SIRT1从而促进了TNF-α诱导的凋亡。
Wang等的研究发现，在人的髓核组织中，miR-494的水平明显增加，他们使用不同浓度的TNF-α刺激人的髓核细胞，发现TNF-α能够诱导髓核细胞的凋亡，并且它的诱导呈现剂量以及时间相关性，并且通过qPCR检测出miR-494的表达量明显增加，使用miR-494抑制剂或者敲除miR-494后，TNF-α诱导的髓核细胞凋亡明显减弱。上述miRNA分子均参与髓核细胞凋亡通路的调控，但上述研究的凋亡相关通路均不具有显著的疾病特异性。而上述miRNA分子是否具有IDD代表性，是否能够反应IDD疾病的特异性改变仍值得进一步研究分析，力求通过寻找IDD特异性改变miRNA分子并明确其机制以为今后的应用研究提供重要理论依据。
miRNA通过影响炎症信号通路参与IDD的发生 众所周知，炎症是促进IDD进程的重要因素，而研究表明部分miRNA也通过此过程影响IDD的进展。Xu等的研究发现，在退变的髓核组织中，硫酸软骨素（CS）的含量明显下降，而5种硫酸软骨素糖基转移酶在退变的髓核组织中的变化却有些不同，通过使用数据库综合分析后，认为miR-29b、-194、-515、-2355可能均能够对CHSYs产生作用，通qPCR研究发现炎症因子刺激后只是miR-194和miR-515明显升高，过表达miR-194和miR-515后发现CHSYs的蛋白水平明显下降，而mRNA水平没有明显变化，使用miR-194和miR-515抑制剂后，CHSYs的蛋白水平明显升高，而mRNA水平没有明显改变。所以他们认为在退变的髓核中，miR-194和miR-515在炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调控CHSYs这一过程中发挥重要作用。
Gu等通过对敲除miR-146a的小鼠研究发现，miR-146a能够减弱炎性因子的作用，认为miR-146a通过抑制炎性因子来参与到保护椎间盘退变的过程。Zhou等的研究发现，IL-6/STAT3信号通路可能通过miR-146a的高表达量来调节腰椎间盘退变，IDD患者的miR-146a、IL-6、STAT3、MMP3、ADAMTS的水平是明显高于对照组的，而Col2和ACAN是明显低于对照组的，使用miR-146amimic后，miR-146a的mRNA水平提高了15倍，IL-6、STAT3、MMP3、ADAMTS的水平明显增加，Col2和ACAN的水平明显下降。而使用miR-146a抑制剂后，miR-146a的mRNA水平降低了66%，IL-6、STAT3、MMP3、ADAMTS的水平明显下降，Col2和ACAN的水平明显上升，所以认为IDD与miR-146a有关，由于IL-6引起的炎症反应和STAT3信号通路的激活，从而影响了髓核组织中Col2和ACAN的表达。Xi等的研究发现，过表达miR-146a后，LncRNAHCG18通过抑制miR-146a-5p和调节TRAF6的表达来促进椎间盘退变，HCG18通过miR-146a-5p/TRAF6/NFκB来抑制髓核细胞的生长和促进椎间盘退变的进程。miR-146a-5p抑制巨噬细胞并且通过TRAF6来保护髓核细胞以防御TNF-α诱导的凋亡。HCG18通过作用于miR-146a-5p来刺激椎间盘退变的进程。所以认为HCG18是miR-146a-5p海绵并且在IDD患者中呈现增加趋势。上述研究表明miR-146可能在IDD的进展中发挥了重要作用。
Cao等的研究发现，IDD组与对照组相比，miR-27a表达量明显增加，在脂多糖刺激的髓核细胞中，减少miR-27a可以降低促炎性因子的水平，也抑制了p38/MAPK信号通路的活性。所以他们认为miR-27a可能是椎间盘退变的一个促进因子，当抑制miR-27a后，那些通过p38/MAPK信号通路影响椎间盘细胞的促炎性因子也得到抑制。Lu等发现在脂多糖刺激过的髓核细胞，miR-589-3P的表达量增加，抑制miR-589-3P可降低细胞中促炎性因子的水平，增加Col2、ACAN的表达，miR-589-3P的下调可以明显减少细胞凋亡。Cheng等发现在IDD患者的NP组织中，miR-200c、miR-130b-p、miR-2355-5p均上升，但以miR-200c的增加最为明显，过表达miR-200c后，细胞凋亡率明显增加，并且增加了MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达，降低了XIAP、ACAN和Col2的表达，说明了miR-200c的促凋亡以及促分解作用，使用TNF-α和IL-1β干预后，miR-200c的表达水平明显增加，敲除miR-200c后，XIAP的表达量增加，并且再使用TNF-α和IL-1β干预后，细胞外基质的凋亡被显著抑制，敲除XIAP能够促进NP细胞的凋亡，并且能够加快ECM的分解代谢和降低ECM的表达，因此认为miR-200c在IDD中通过XIAP发挥其促炎性作用。Jing等的研究发现，在退变的NP组织中，miR-93的表达量下降，并且和椎间盘退变程度相关，在NPCs中，miR-93能够诱导Col2的表达，并且抑制MMP-3的表达，过表达miR-93后，Col2在mRNA和蛋白水平均明显增加，但这一作用可被MMP-3显著抑制，在退变的NP组织中，miR-93的表达与MMP-3mRNA的水平呈明显的负相关关系，因此认为，miR-93通过作用于MMP-3从而增加Col2的表达。上述miRNA分子尽管能够直接影响炎症相关通路或因子，是重要的疾病促进因子，但其本身表达改变的机制仍需进一步明确以确定其在IDD发生发展中的作用与价值。
miRNA通过影响细胞外基质生成参与IDD的发生 在椎间盘退变过程中，细胞外基质合成减少，分解代谢增加，表现为ACAN含量的降低、Col2向Col1的转变,部分miRNA通过靶基因进而影响了髓核组织细胞外基质的合成分解代谢过程。
Zhang等收集了20例IDD患者的样本以及20例与IDD样本年龄、性别相匹配的正常椎间盘样本，在使用limmapackage法对椎间盘退变样本和对照组样本时发现，miR-3150a-3p是上调的miRNA中最明显的。Aggrecan（ACAN）被认为是miR-3150a-3p的直接靶基因，并且miR-3150a-3p可以调节ACAN的表达。在髓核细胞中，过表达miR-3150a-3p时，通过qRT-PCR，WesternBlot等方法发现ACAN的表达降低；抑制miR-3150a-3p时，ACAN的表达增加，而ACAN的表达与IDD分级呈负相关。所以他们认为在IDD的病程进展中miR-3150a-3p的增加诱导了ACAN的表达下降。
Liu等的研究发现，在退变的髓核组织中，miR-132的表达量增加。过表达miR-132后，MMP3、ADAMTS4在mRNA和蛋白水平的表达均明显增加，髓核细胞中GDF5的mRNA和蛋白表达均被抑制，抑制miR-132后，Col2和ACAN的水平升高，MMP3、ADAMTS4在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低，髓核细胞中GDF5的mRNA和蛋白表达均增加。在人的髓核细胞中，miR-132通过靶基因GDF5发挥作用，miR-132/GDF5的作用通过MAPK/ERK通路发挥，抑制miR-132能有效阻止髓核细胞中细胞外基质的退变。
Tan等的研究发现，在退变的NP组织中，miR-665的表达量明显增加，并且增加的程度和椎间盘退变的程度成正比，过表达miR-665后，MMP-13表达量增加，ACAN和Col2的表达量降低，并且抑制了GDF5的表达，过表达GDF5后，减弱了miR-665对ACAN、Col2、MMP-3、MMP-13的作用，因此认为，miR-665的增加通过降低GDF5的表达能够促进NP细胞增殖，促进ECM的退变。
Ji等的研究发现，在退变的NP组织中，miR-193a-3p的水平降低，并且miR-193a-3p的水平与椎间盘退变的程度呈负相关，过表达miR-193a-3p后，Col2的表达量明显增加，MMP14水平显著下降，而抑制miR-193a-3p后，Col2的表达量明显降低，MMP14水平显著提高，在小鼠模型上，加了miR-193a-3p的小鼠与正常小鼠的椎间盘相比，Col2和ACAN的水平增高，Col1和MMP14的水平降低。因此认为在椎间盘中，miR-193a-3p通过靶基因MMP14来发挥作用。
上述miRNA均能够通过直接影响基质合成基因而产生影响IDD进程的作用，然而这些miRNA的上游调控机制以及其对ECM以外基因的影响是目前待解决的关键问题。通过高通量蛋白或RNA测序手段明确其在髓核细胞整体水平的改变来找出关键通路与关键靶分子的方法比目前现有研究结果更为有价值。
总结与展望
综上，我们发现目前针对椎间盘退变中MicroRNA的研究主要集中在髓核细胞凋亡、炎症信号通路以及细胞外基质的变化这三方面。且相较于纤维环以及软骨终板，对髓核细胞的作用首当其冲。然而，目前绝大多数研究均以miRNAs的表达量变化为前提，只针对细胞凋亡或炎症信号通路或细胞外基质中的其中一者进行机制研究，并不能够提供有力的证据证明其实际作用，此外缺乏相关动物研究也使得上述成果均停留在标本及细胞水平。
miRNAs由于与靶基因3′-UTR进行的是不完全互补结合，所以能抑制多个靶基因mRNA的表达，从而在一定程度上抑制靶基因的生物作用。同时又具有高度的时空特异性，以及组织特异性。这些特性对研究MicroRNA在椎间盘退变性疾病中发挥的作用既提供了基础，也带来挑战。因此对椎间盘有特异性作用的MicroRNAs仍需进一步研究。因此，后续研究应当建立在高通量组学基础之上，通过针对单一miRNA干预明确其对髓核或其他椎间盘细胞的整体改变入手，分析关键通路及因子，这样才能更为有效地给出具有疾病特异性的关键调控分子，以为后续应用研究打下重要理论基础。
众所周知，椎间盘退变的机制复杂，由多种因素共同作用导致，而椎间盘退变目前的相对有效的治疗方法只有手术治疗，如若能够早期识别诊断椎间盘退变，可延缓椎间盘退变的进程，给患者带来福音。已有的对miRNAs的研究成果通过对miRNAs表达量的检测来早期诊断椎间退变提供了一种可能。
-
项目成果
