一、材料准备
1. 细胞系培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），37℃，5%CO2，孵箱培养。
2. 人宫颈癌上皮细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5% CO2 孵箱培养。 二、实验步骤
1. 杂交体Tec ORF的获得
（1）人Tec与大鼠、小鼠Tec具有高度同源性 。由于人Tec ORF编码框上游引物退火温度较低，不宜直接PCR从文库中调取，故采取两步法，首先用小鼠Tec 5‘引物与人的Tec 3 引物在大鼠文库中扩的杂交体Tec读码框。
（2）引物：上游：5 ’ATG ATG GTG TCA TTC CCT GTC AAA-3’，下游：5 -GC TCT AGA TCT TCC AAA AGT TTC TTC ACA-3’，模板：大鼠cDNA文库。
（3）PCR体系25 ul，退火温度42℃，5个循环，再提高退火温度至48℃ ，反应28个循环。
（4）PCR产物经1%琼脂糖电泳发现一条1.8 kb 左右片段，回收酶切后连入PMD-T载体，小规模细菌扩增后随机挑取20个菌落，用PCR法与酶切法筛选阳性克隆，再经测序比对序列。 2. 人Tec真核表达载体的构建经测序证实杂
（1）交体Tec ORF与人Tec ORF在5 端相差一个碱基，进而合成一条新5 引物：5’ATG ATG GTG TCA TTCCCT GTC AAlA-3‘；下游引物仍为人Tee含Xba 1酶切位点的下游引物。
（2）以杂交体T为模板。退火温度52℃，5个循环，再提高退火温度至58 ℃，反应28个循环。
（3）1%琼脂糖电泳发现1.8 kb 左右片断．收酶切后用T4 DNA连接酶连接于pc-DNA 3.1真核表达载体。
（4）连接产物做小规模细菌转化，PCR及酶切鉴定后经测序证实。 3. pCDNA3.1瞬时转染细胞
（1）Hela细胞1×106接种于90 mm 平板，待贴壁后长至70% 密度时进行转染pCDNA3.1质粒10 ug、脂质体12 ul 与无血清DMEM混匀后轻覆细胞。
（2）转染10 h 后换含10%FBS的DMEM培养至48 h。
（3）加入RIPA（97.5%PBS、1% NP 40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1%SDS）冰上裂解30 min。
（4）4℃ 离心取上清，提取总蛋白（10 g/组） 经10% SDS—PAGE胶分离。
（5）电转（100 mA、120 min）至PVDF膜上。
（6）膜用TBST中封闭，3 h 后置于含抗Tec抗体（1：1 000）的TBST中室温孵育1 h，再加人相应结台的二抗后与ECL发光检测剂结合显示结果。 | 
