细胞凋亡（apoptosis）的检测-2
【材料】
１试剂：吖啶橙贮存液（10mg吖啶橙溶解于100mLPBS中，过滤，4℃避光保存），0.01mol/L、Ph6.8PBS。
２器材：吸管，试管，玻片，荧光显微镜。
【方法】
１制备待检活细胞悬液，浓度约为1×10７/mL。
２取95uL的细胞悬液，加5uL的吖啶橙贮存液混匀。
３吸一滴混合液，点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
４荧光显微镜观察或避光保存于4℃，待观察。
【结果】
在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄色或桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。
（2）琼脂糖凝胶电泳法
【原理及意义】
培养或单细胞悬液用细胞裂解液消化细胞按常规法提取DNA后，置于含溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，细胞出现PCD时呈典型的“梯状”条带，而坏死时，呈模糊的弥散膜状条带。
【材料】
１试剂：缓冲液，细胞裂解液，Rnase（10mg/mL溶于TE缓冲液中），醋酸钠，乙醇，苯酚和氯仿。
２器材：电泳槽，电泳仪。
【方法】
１约10６细胞洗脱后，1000ｒ/min离心5min，去上清。
２用4mL的PBS重悬洗后，同法离心去上清。
３置液氮中骤冷，5min（无条件可省略）。
４加0.5～1mL细胞裂解液重悬细胞，50℃，过夜，不时振摇。
５加等体积酚和氯仿、异戊醇各抽提1次（充分混匀，5000ｇ，5min）。
６取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，混匀。
７液氮10min，1000ｇ，5min离心沉淀DNA，70%乙醇洗１次后，真空抽干，溶入500uLTE缓冲液中。
８加入25uL Rnase，37℃水浴，30min。
９取所制备的样品1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察。
