PLOS：观察艾滋病毒从细胞中出芽
最近，美国犹他大学的研究人员发明出一种方法，来观察新形成的AIDS病毒颗粒从受感染的人类细胞显露或“出芽”，而不会干扰这个过程。利用这种方法，研究人员发现，一种称为ALIX的蛋白质介入了病毒复制的最后阶段，而不是以前认为的较早阶段。
相关研究结果发表在2014年5月16日的《公共科学图书馆期刊》（PLOS ONE），本文资深作者、物理与天文学助理教授、病毒学家Saveez Saffarian指出：“我们每次观察一个细胞，使用数码相机和特殊的显微镜，拍摄出芽过程中的视频和照片。”
“我们第一次看到，ALIX被招募到HIV的出芽过程中。大家都知道ALIX参与HIV的出芽过程，但是没有人能将ALIX到该过程的招募可视化。”
Saffarian称，这一发现属于基础科学，对艾滋病患者没有直接的临床意义，因为ALIX参与了太多的重要功能（如细胞分裂），因此不能作为新药物的一个可能靶标。
他补充说：“我们非常了解这些帮助HIV脱离细胞的蛋白，但是我们不知道它们是如何团结在一起帮助病毒脱离的，在未来的10到20年，我们将对这一机制有更多了解。它将会是一个药物靶点吗？将是用于以后治疗或生物技术行业的生物化学的一部分么？现在我不能给出答案。但是如果不是因为我们的好奇心，就不会有今天的这项新技术。”
犹他大学医学院生物化学系主任、HIV出芽专家Wes Sundquist教授表示：“这项新研究工作非常的出色，对于我们这些研究HIV组装机制的人来说，这是真正的兴趣。”
这项工作是由美国国家科学基金会资助。第一作者为犹他大学物理学博士Pei-I Ku，共同作者还包括：物理学和天文学博士后Mourad Bendjennat、技术员Jeff Ballew和博士后Michael Landesman。
观察HIV出芽
多年来，研究人员利用生化方法，包括在实验室玻璃器皿中收集上百万种病毒，进行不同的分析，揭示构成病毒的蛋白质，例如利用结合到某些蛋白质上的抗体，以及使第一个蛋白发出荧光的其他蛋白质。
Saffarian称：“你不能同时在一种病毒内进行这些分析。因为你没有看到相似病毒之间的差异。你没有看到各种蛋白质来来往往帮助病毒脱离细胞的时机。”
其他一些方法，当HIV颗粒在细胞上出现时，将其冷冻或固定在细胞上，并用电子显微镜拍摄这些病毒复制的定格图像。Saffarian也使用称为“全内反射荧光显微镜”的技术，这种技术已被用来观察细胞中的动态过程。
以前，有研究人员使用这种方法，实现了HIV和一种相似的马病毒（EIAV）的出芽成像。但是，Saffarian称，他们的研究并没有表明ALIX参与HIV出芽，并且有缺陷，因为它们错误地指出，ALIX蛋白介入EIAV出芽过程的较早阶段，在HIV出芽过程中也同样。
Ku、Saffarian及其同事将这种显微镜技术与改进的方法结合，在克隆细胞中，通过遗传学手段将一种绿色荧光标签结合到ALIX蛋白，因此他们可以看到蛋白质，而无需伤害其正常的结构。研究人员尝试了许多所谓的“接头序列（linker）”，找到了一个接头序列可使他们看到介入HIV出芽的 ALIX蛋白，而不会干扰这个过程。
他补充道，无论是显微镜技术，还是绿色荧光标记蛋白都不是新的，但是这项研究的创新之处在于，使用了许多不同种类的连接序列，将这些荧光蛋白结合到ALIX，以找到可让ALIX蛋白正常运转的那一个连接序列。
Saffarian称，早期研究表明ALIX蛋白介入出芽过程的早期阶段，但问题是，这些研究只使用了一个连接序列，从而削弱了ALIX的正常功能。
观察蛋白质形成HIV
当HIV在人类细胞内复制时，一个称为Gag的蛋白构成其大部分新颗粒——每个HIV颗粒中有4000个Gag蛋白拷贝，虽然其他一组蛋白也参与了这个过程，包括ALIX，这代表“alg-2互作蛋白x”。Saffarian研究小组所使用的病毒样颗粒，是被剥夺基因蓝图或基因组的HIV颗粒，所以它们在实验室不会造成感染风险。并且，病毒样颗粒能够保持与传染性HIV相同的几何形状和萌芽过程。
在病毒出芽期间，Gag蛋白在细胞膜里面组装——在后期阶段与ALIX一起，形成一个新的HIV颗粒并使其脱离细胞，艾滋病患者中的AIDS可通过这个过程，从一个细胞传播到另一个细胞。
为了观察出芽过程，Ku、Saffarian和同事们把包含病毒颗粒的人HELA细胞放入培养皿的少量液体培养基中，将其放置在显微镜下，这是一个保持在体温状态的玻璃室，因此细胞能够存活超过48小时。一束固态蓝色激光瞄准样品，使绿色标记的ALIX蛋白和红色标签Gag蛋白发光或发荧光，以便于它们组装成病毒颗粒时可被观察到。
Saffarian指出：“利用红色标记的Gag蛋白和绿色标签的ALIX蛋白质，我们能够看到ALIX出现在病毒颗粒组装的后期，大约100个 ALIX蛋白质与大约4000个Gag分子融合，并组装成一个新的HIV颗粒。然后，ALIX引进两种其他蛋白质，它们可在出芽病毒颗粒浮现时，将其从细胞上切断。在这之前，还没有人确定ALIX在新病毒颗粒挤压断离期间所处的位置。”
研究人员每次观察来自一个细胞的病毒颗粒出芽：通常其中有100个在两小时内出现。Saffarian称，大多数ALIX蛋白质在HIV组装完成后离开，并返回到细胞内液中。
他认为，ALIX直到HIV出芽的晚期阶段才参与其中，这说明病毒中存在一种以前未被确认的机制，这一机制可调节ALIX和其它蛋白在组装新HIV颗粒过程中的时机。
Saffarian指出：“我们发现，帮助病毒释放的细胞成分，实际上到达的时间要以比基于生化数据预测的更为复杂。这项研究结果非常有前景，因为它揭示了细胞成分招募到HIV出芽部位的一种新调控机制，并为未来HIV出芽机制的研究打开了大门。”
-
仪器推荐
-
仪器推荐
询底价 Tel：400-6699-117 转 9815 -
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐
-
项目成果
