Western Blot蛋白质磷酸化操作小贴士
WB 是检测和定量磷酸化蛋白质的重要实验方法，然而大家一直都说磷酸化蛋白 WB 不好做！WB 磷酸化蛋白曝不出条带的时候，会特别沮丧。
在此给大家列出几点小建议，希望能帮助您改善一下实验结果。
1、样本是否表达：
查阅资料或通过预实验确定。
2、对照设置：
阳性和阴性对照。
总蛋白抗体对照，对于特定时间的特定样品，磷酸化和非磷酸化蛋白质的总和代表该特定蛋白质的总量。在相同的 WB 检测中， 磷酸化蛋白质的量增加通常伴随着非磷酸化蛋白质的降低。
3、内参设置：
根据实验选择合适的内参，如Actin、GAPDH 等
4、适当的提取方法：
蛋白质提取的方法不仅影响提取效率，还会影响蛋白的质量。建议采用裂解液裂解和超声破碎组合的方式，可确保整个样本充分裂解。
5、低温操作：
室温条件下，磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融，操作时一定置于冰上。
6、加入抑制剂：
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化，因此，必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。
7、最重要的一点：
检测时选择近红外荧光标记抗体，一次可检测多个蛋白，无需多次曝片，方便检测。一般磷酸化和总蛋白的条带位置十分接近，传统方式不易区分。
Azure C系列检测近红外时，采用的是激光光源。由于近红外荧光染料激发波长和发射波长非常靠近<20nm,只有激光才能取得最佳的检测效果。
这样大家在用WB检测磷酸化水平时，是不是就方便多了，不用像传统方法那样，在压完磷酸化抗体后，将膜 strip 后再压总蛋白抗体；也不需要同时跑两块胶分别检测。
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