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BEX电转化仪高效转染mRNA入卵助力CRISPR/Cas9基因编辑

2020.5.18

BEX电转化仪高效转染mRNA入卵助力CRISPR/Cas9基因编辑

摘要

近期，CRISPR/Cas9系统被广泛地应用于突变体小鼠的构建，但是借助于微注射方法很大程度上限制了基因编辑于高通量上的应用。这篇文章中，我们阐述了一个简单，高效，大规模的基因编辑方法：即借助于电转染将RNAs转入卵，而不是通过显微注射。我们用这种方法将单链寡脱氧核苷酸（ssODN）转入小鼠卵，构建敲除突变体。研究结果证明此方法使得大规模基因分析成为现实。

材料和方法

小鼠、卵和胚胎

使用ICR和B6D2F1(C57BL/6XDBA2F1)孕鼠。ICR主要用于电转条件摸索，而B6D2F1用于基因编辑。

从E0.5的输精管中收集受精卵。ICR和B6D2F1和同种雄鼠自然杂交。基因编辑试验中，从B6D2F 1和R26-H2b-mCherry雄性杂交得到的卵，培养在mWM培养基中等待电转染。

电转染

应用BEX定制电极（长：10mm，宽：3mm，高：0.5mm，间距：1mm）图1.

电极连接在CUY21EDIT II主机上面（BEX，Tokyo，Japan），并将电极置于体视显微镜下。培养在mWM中的卵用Opti-MEM I 清洗三次。加入5ul的RNA进行混合，放置于电极狭缝中。可以电转40-50个胚胎。电转条件设定为30V，7times。电转之后，立即将卵转出在mWM培养基中，37℃,5%CO2培养。转染后15h观察mCherry荧光。

结果与分析

分别借助mCherry mRNA和无肢基因Fgf10进行转染，得到电转受精卵存活并发育成两细胞阶段的比率是94-95%，比微注射方法（34-35%）要高很多。

当我们使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA进行转染，87%的胚胎表现出缺失前、后腿，图2c（type I）所示；对I型突变体进行测序，发现Fgf10基因等位基因全部被打断。

随后，我们检测了不同浓度的Cas9 mRNA和gRNA对于基因编辑的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/u的gRNA，73%的胚胎无肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢体残缺（图2bc)；50ng/ul Cas9 mRNA 和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。

为了进一步确定基因组编辑的效率，将mCherry mRNA转入11只小鼠中，发现所有11个小鼠都没有红色荧光（图3b）。这一结果说明电转染的方法还可以用于高效产生HDR介导的基因敲除小鼠。

接下来，我们探讨了这种突变是否会在下一代中遗传下来。电转200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵细胞，靶向mCherry基因。观察25只F0代小鼠，均无红色荧光表达。而且所有的F1代小鼠同样没有红色荧光，说明mCherry基因被打断。以上揭示了应用该电转染方法得到的基因编辑突变体是可以稳定遗传。