电转化仪高效转染mRNA进入小鼠受精卵形成稳定突变体
摘要
随着小鼠基因组序列测序完成，许多研究都围绕着功能基因参与的生物学过程，特别是发育和疾病研究领域。那么稳定遗传修饰的模型动物对于阐明基因的作用十分重要，然而，传统的方法，包括在胚胎干细胞中的同源重组或是构建小鼠嵌合体，既耗时又耗力。然而新的基因组编辑方法明显的优化这个过程。在有效的基因组编辑方法中CRISPR/Cas
9系统是构建携带修饰基因组最简单的方法。
虽然，CRISPR/Cas9系统简化了形成突变体的过程，但是将DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技术，得到大量的突变体也十分耗时间（注射数以百计的受精卵）。那么，为了简化这个过程，我们尝试用电转化仪将RNA导入受精卵。
电转也被用于过小鼠受精卵，但是过程涉及去除卵透明带，或是用酸台氏液薄化处理，这些对细胞是非常有毒性的，而且只有短小的RNAs（短于1kb）可以被导入。
近期，一只大鼠突变体成功构建，借助于在保持卵透明带完好的前提下转染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因组编辑的效率很低（低于9%），而且需要大量的Cas9（1000-2000ng/ul）。
方法与结果
为了优化电转条件，我们使用BEX CUY21 EDIT II电转化仪，以及铂金块电极，1mm间隔（图1abc）。放在体视显微镜下，并连接电转化仪。每次加入5ulRNA，可以电转40-50个胚胎。
为了提高基因组编辑效率，分别借助mCherry mRNA和无肢基因Fgf10，优化参数，得到电转受精卵存活并发育成两细胞阶段的比率是94-95%，比微注射方法34-35%要高很多。
当我们使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA进行转染，87%的胚胎表现出缺失前、后腿，是图2c（type I）；10%的突变体是肢体残缺（type II）;只有3%的胚胎表现为正常（type III）。对I型突变体进行测序，发现Fgf10基因等位基因全部被打断。
随后，我们检测了不同浓度的Cas9mRNA和gRNA对于基因编辑的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，73%的胚胎无肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢体残缺（图2bc)；50ng/ul Cas9 mRNA 和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。
Figure 1. Optimal conditions for the electroporation used to
deliver mRNA into fertilized eggs.(a) Electroporation set-up used in
this study. The right box is the electroporator CUY21 EDIT II (BEX
Co.Ltd),which generates electric pulsed, and the left is a stereoscopic
microscope for embryo manipulation. Two electrodes were placed on the
microscope stage and connected to the electroporator.
Figure 2. CRISPR/Cas9mediated genome
editing by electroporation. (b)Examples of embryos from the three
classes that exhibited different limb phenotypes: no limbs (type I),
limb defects (type II, left hind limb deficiency, right: truncated
fore-and hind-limb) , and normal (type III).(c)Graph summarizing the
effects of Cas9 and gRNA electro-poration on limb development. The
concentrations of RNAs used in each experiment are shown at left. The
numbers in each column are the number of embryos exhibiting the
phe-notype in each category.
Figure 3. The single-stranded
oligodeoxynucleotide(ssODN)-induced generation of HDR-mediated
instertions.(b) Representative embryo electroporated with Cas9 mRNA,
gRNA, and ssODN.The mCherry florescene completely disappeared in the
electroporated embryos, while control (no electroporation) embryos
displayed florescent signals.
为了确定基因组编辑的高效，转染mCherry入11只小鼠中，发现所有11个小鼠都没有红色荧光（图3b）。这一结果说明电转染的方法还可以用于高效产生HDR介导的基因敲除小鼠。
接下来，我们揭示了这种突变是否会在下一代中遗传下来。电转200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵细胞，靶向mCherry基因。观察25只F0代小鼠，均无红色荧光表达。而且所有的F1代小鼠同样没有红色荧光，而且mCherry基因被打断。说明基因编辑突变体可以稳定遗传。
讨论
综上所述，我们确立了一个电转条件，保证基于CRISPR/Cas9的基因组编辑的高效和高存活率。因为电转染不需要微注射技术，而且可以同时对40-50个胚胎进行处理，这种方法较之以前的方法能更快更简单的得到大量的稳定遗传突变体小鼠。应用这个方法，可以为分析F0表型进而筛选发育相关重要基因奠定基础。
