免疫球蛋白G(IgG)的纯化—蛋白G交联琼脂糖凝胶亲和层析
| 实验步骤 |
蛋 白 G 和蛋白A 在 不 同PH 下结合抗体的能力不同：蛋 白 G 在 低 pH 下与抗体结合力强，在 高 pH下与抗体结合力弱。但 一 些 抗 体（小 鼠 IgG1 和兔、人抗体）在 高 pH(8〜 1 0 ) 下仍与蛋白G 结合 。 一 般 推 荐 最 好 在 pH5 时结合抗体，在 PH2. 8 时洗脱抗体 。此法适用于小鼠IgG1、大 鼠 抗 体（多数亚类结合力弱而： ^0% 结 合 力 强）、猴抗体、兔抗体、牛抗体、山羊抗体、马抗体和绵羊抗体等。 附 加 材 料（其他材料见基本方案2 )0.lmol/L 乙酸钠， pH5. 0 0.lmol/L 甘 氨 酸 •HC1， pH2. 8 HiTrap 蛋白 G 柱（Pharmacia Biotech 或 Sigma) la 适用于腹水：用玻璃棉去除腹水中脂类（见基本方案 1 ，步 骤 la ) 。 lb 适 用 于 M Ab上清：于 4°C将 MAb上 清 以 20 OOOg离心后用0.45um过滤器过滤。 2.用 0. lmol/L乙 酸 钠（pH5 . 0 ) 将腹水上清和生物反应器上清稀释1 0 倍 或 将MAb上清 稀 释 2 倍以上。 3.用 0. lmol/L 乙 酸 钠（pH5 . 0 ) 平 衡 HiTrap蛋 白 G 柱并上样，每毫升树脂一般可结合 约 IOmg蛋白质，但不同种属抗体结合量有所不同。 4.用 数 倍 柱 体 积 的 0. lm ol/L乙 酸 钠（pH5 . 0 ) 洗 柱 ，再 用 0. lmol/L甘 氨 酸 •HCl(pH2. 8 ) 缓冲液洗脱结合的抗体。 5.合并含目的蛋白的组分并透析（见基本方案2 , 步 骤 4)。 6.先 用 0 •lm ol/L 甘 氨 酸 •HCl (pH2 . 8 ) 洗 柱 再 生 ，然 后 用 0•lm ol/L 乙酸钠(pH5. 0 ) 再平衡柱子保存。 展 |
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