完全基因剔除转基因动物
实验概要
本文介绍了完全基因剔除转基因动物的方法。完全基因剔除(entirely knock-out)：又称基因敲除、基因打靶，指应用一段与胚胎干细胞染色体上的一段序列具有高度同源性的外源DNA，通过同源重组直接将靶基因在动物个体中的活性完全消除，来观察靶基因失活、不表达的情况下会对动物个体产生哪些影响。
实验步骤
1. 基因剔除的技术路线
2. ES细胞
1) ES细胞在合适的体外培养条件下，可使细胞保持分化的全能性。
2) 已建立了非常完善的筛选体系，很容易获得同源重组的细胞群体。
3. 构建打靶载体
1) 置换型载体
基本元件包括：与靶位点两侧同源的同源序列臂、正选择标记基因、细菌质粒序列和载体上同源臂外侧的线性化位点。
2) 插入型载体
主要元件包括：打靶位点的同源序列(至少含有一个惟一的限制性内切酶位点，可用作线性化位点)、正选择标记框及细菌质粒的骨架。
3) 选择性标记基因
a. Hprt基因：
编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶可以将核苷类似物代谢成对细胞有毒性的物质，基因剔除后的细胞可以在含有核苷类似物的培养基上存活。
b. 正-负选择系统(positive-negative selection，PNS)载体：
正选择标记基因neo，被插入到靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，以使靶基因彻底失活。
胸腺嘧啶激酶(HSVtk)基因作为负选择标记基因插入到同源序列的一侧。HSVtk基因产物以核苷酸类似物(FIAU，GANC)为底物，将其代谢成对细胞有毒性的物质，使细胞被杀死。
4) 囊胚注射获得嵌合体小鼠
a. 将发生同源重组的ES细胞注射到胚腔中，或采用ES细胞与细胞期胚胎聚合的方法获得嵌合体胚胎。
b. 将嵌合体胚胎移植到同期发情的假孕母体子宫内,发育成一个嵌合体。
c. ES细胞所携带的靶基因要遗传，ES细胞必须整合到嵌合体的生殖细胞中去。
d. 再连续的向背景品系逐代回交8-10代后，将两个带有单拷贝基因剔除的杂合体鼠互交，就可以获得双拷贝纯合体的基因剔除小鼠。
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