Western Blot全自动分析仪与传统WB方法的比较
Western Blot全自动分析仪与传统WB方法的比较，传统Western blot方法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（硝酸纤维素膜即NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。其实验步骤主要包括以下几个：
一．配胶跑胶
1、根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般釆用10%的SDS－PAGE）
2、将已配制好的凝胶装入电泳仪中（注意不要漏液）。
3、设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液我们按10-20ul/道点样，重组蛋白按1-2ug/道点样。
4、把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。
5、从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。
二．转膜
1、 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。
2、 带上手套，准备好滤纸和NC膜，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
3、 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。
4、 按“海绵—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反）
5、将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
6、将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移90min。电转完毕后，将NC膜作好记号置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。
三．封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
四．发光鉴定
一最常用的化学发光标记酶是辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）显色法。通常需要暗室，或专业的化学发光凝胶成像仪（www.bio-launching.com）以及分析软件进行分析。
不难看出其步骤的繁杂性，这其中每一步的失误都会造成全盘失败，从而重复实验，对于珍贵样品，更是要倍加小心。另外，试验流程长，结果重复性差，要达到好的实验结果，成本也会很高。同时，所需实验仪器如，电泳、转印、成像分析（或暗室）等的操作也较为复杂，增加了实验的难度。在传统方法下，如果想得到一个较为理想的实验结果，往往需要实验者有着非常高超的实验技巧和娴熟的实验仪器操作经验。所以，科学家们一直在寻找一种革新的技术来克服Western传统技术的不足，发扬它的优势，直到2011年底，专门从事蛋白质分析研究技术的美国ProteinSimple公司经过多年开发，在全球推出独一无二的全自动Western Blot分析系统Simon，从而使Western实验变得简单，高效。
全自动Western Blot分析系统Simon将Western blot的所有实验步骤自动化，包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析，即保证了实验结果的重复性。
操作者只需简单的放上样品，然后敲击“开始”，就可以离开。只需约三个小时后，即可回来读取已经分析好的数据结果。，如果不确定整个过程的分析时间，SimonTM在实验结束后会以声音提醒，一起就是如此简单！
它主要是在400nl样品管中完成Western blot的所有实验，仅需5ul的样品量，节约珍贵样本；结果具有高度重复性，CV≤10%。自动化上样机具有多个参数可自行设定，包括分离时间、封闭时间、一抗和二抗孵育时间、检测时间。
实验数据的分析是由Compass软件自动处理，样品数据的表现形式与传统的结果保持一致并具有更好的灵敏度与重复性。提高了分析系统定量的准确性。
介绍完以上两种方法，我们在此简单地总结Western Blot全自动分析仪与传统WB方法的比较：
一、 自动化程度不同：传统的WB方法需要跑胶、转膜、抗体杂交以及发光成像与分析多个步骤，每个步骤都需要依靠经验和摸索进行，且每个步骤之间需要人工操作，直至得到分析结果。而全自动WB分析仪仅需要简单的放入样品和相应程序的设置，然后有系统直接得出结果，整个过程全自动化，实验过程简单易操作。
二、 实验重复性不同:传统WB方法繁杂的实验步骤、较长的实验周期以及其几乎全部手动操作的实验方式直接决定了其较低的实验重复性。几乎其中每一步的失误都会给实验结果造成差异性较大的实验结果，特别是对于初级实验操作人员，如果想得到较为可信的实验结果几乎要接受大量的技能培训与许多次的失败教训。
三、 实验时间（效率）不同：传统WB方法需要几乎两天的时间，而全自动Western blot分析仪仅需要数小时时间即可获得实验数据。
四、 实验成本不同：传统的WB方法需要样品量较大，在几乎完美无失误的实验过程也需要多种较为高昂的实验试剂耗材及大量的时间和人力投入，如果实验失败其实验成本有时几乎不可预测。而全自动Western blot分析仪仅需不超过5ul的样品量和少量且经济的实验试剂耗材，在数小时内即可获得可靠的实验数据，实验成本低廉且可估计，对于一些关键实验来说几乎最大程度的保证了实验方案甚至是项目的顺利进行。
当然，Western Blot全自动分析仪因其专业性强仪器购置价格略微较高，目前其受众仅为有着大量、专业、高效率实验需求的用户。而普通WB方法中的各种仪器设备几乎可以兼做其他各种凝胶成像实验，适用性更广。
