脐血脐带中干细胞分离实验—脐血来源胚胎样干细胞分离
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 灭菌培养基TPOFLK细胞因子混合物（10 ng mL促血小板生成素50 ng mL Flt-3配体和20 ng mL c-kit配体）ACD-A缓冲液小鼠抗人CD45CD33CD47单克隆抗体抗血型糖蛋白A抗体2%人丙种球蛋白（HAG。用PBSA溶解）磁珠标记的人IgG4抗总小鼠IgG单克隆抗体0.05%胰蛋白酶含EDTAPBSA |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | (a)分离和制备CB-MNCs。 (b)根据以下免疫磁珠分选的方法纯化原始系限制性干细胞。 (c)用2%HAG处理MNCs，4℃放置20 min。 (d)用小鼠抗人CD45,CD33，CD37和抗血型糖蛋白A单克隆抗体标记MNCs，4℃标记30 min。 (e)用ACD-A缓冲液洗细胞，400g，4℃离心10 min。 (f)用ACD-A缓冲液再洗一遍。 (g)用磁珠标记的人IgG4抗总小鼠IgG单克隆抗体标记MNCs 30 min。 (h)根据产品说明书用磁分离器分离系特异性分子阴性（Lin-)的细胞群体。 (i)按以下步骤安装细胞分离装置和硅酮管：用70%乙醇灌洗10min。用水洗两遍，每次5 min。用5%BSA/PBSA润洗。用弹簧夹夹住硅酮管的下段，用带子将硅酮管安全地固定在磁分离器中。 (j)分离细胞前，用培养基加满细胞分离装置中的硅酮管，使通过柱子的流速控制在5mL/min以内。然后，用微量吸管将细胞/磁珠混合悬液加到管中，刚好低于液体的弯月面。 (k)用巴氏吸管，不断添加培养基，防止管上的细胞脱水。 (l)用15mL离心管收集流出的部分（含没有结合磁珠的细胞，Lin-细胞）。 (m)用台盼蓝染色进行活细胞计数。 (n)用含TPOFLK细胞因子混合物的培养基将UCB来源的Lin细胞接种到没有包被过的6孔培养板中，接种浓度为2.7×104个细胞/mL。 (o)将细胞在37℃,5% CO2的条件下培养，每周一次更换培养基和细胞因子。 (P)必要时，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化贴壁细胞，按1×105个细胞/mL浓度接种到新培养瓶中，按上述条件继续培养细胞。 展开 |
