对流免疫电泳
【原理】
对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIEP）是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用抗原，抗原向正极移动，抗体向负极移动。将抗原放负极端，抗体放正极端，则抗原抗体相向移动，在两孔之间相遇，在比例合适时形成沉淀线。以Sm和RNP（核糖核蛋白）等可提取性抗原（extractable nucleat antigen，ENA）检测相应抗Sm和RNP为例。
【材料】
1． Sm/RNP抗原制备 将新鲜或冻存于-30℃的小牛胸腺除去脂肪与结缔组织后，用0.004 mol/L 氯化钙-0.28 mol/L蔗糖溶液洗净，切碎。每50 g胸腺加上述含钙0.28 mol/L蔗糖450 ml。于匀浆器中慢档（约8000 r/min）匀浆2～3 min（速度过高，核可能破坏）。两层纱布过滤，滤液1500 r/min离心20 min，弃上清液（胞浆成分）。沉淀（核）用0.004 mol/L氯化钙-0.25 mol/L蔗糖洗1次。用50 ml pH 7.1 0.1 mol/L PBS（或pH 7.2 0.01 mol/L PBS）将沉淀物悬起，于匀浆器中快档匀浆2～3 min，使核破碎。4℃过夜后用纱布滤除不溶性物质，滤液以30000 g 4℃离心1 h除去沉淀物。上清液按10 mg/ml比例加入醋酸钠干粉，缓慢搅拌至溶。加入6倍体积的无水乙醇，发生絮片状沉淀，10 min后1500 r/min离心10 min。弃上清液，沉淀中加入生理盐水20 ml，使大部分溶解，1500 r/min，弃沉淀。上清液对蒸馏水透析后分装，冷冻干燥保存。
2． 待检血清和已知抗ENA阳性血清。
3． PH 8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液。
4． 琼脂、载玻片、吸管、毛细滴管、打孔器、电泳仪、电泳槽、万用表、适量滤纸或纱布。
【方法】
1． 制备1.2%巴比妥缓冲琼脂凝胶板 先用生理盐水50 ml加1.2 g琼脂隔水煮沸融化，再加50 ml pH8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液继续隔水煮沸至澄清，取融化的琼脂3.5～4 ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。
2． 打孔 用打孔器（或用绘图笔尖）成对打孔，孔径3 mm，孔距6 mm。
3． 打样 先于阳极侧孔内加待检血清或阳性对照血清，10 V/cm电压，电泳30 min（时间可随具体实验条件加以调整），再于阴极侧孔内加ENA抗原（巴比妥缓冲液溶解的），继续电泳约45 min。
4． 待阳性对照血清孔与ENA抗原孔之间出现白色沉淀线时停止电泳。
5． 初步观察后，将凝胶板置湿盒继续扩散24 h。
【结果】
判定结果时，待检血清如含抗RNP与抗Sm两种抗体则在与ENA抗原孔之间出现两条沉淀线，靠近阴极侧的沉淀线由抗Sm与相应抗原形成，靠近阳极侧的沉淀线则由抗RNP与相应抗原形成。如只出现一条沉淀线，则须与阳性对照血清参比，以判定其性质。由于Sm抗原可耐56℃ 1 h，RNP则遭破坏，故也可将ENA抗原加热处理后再与待测血清作对流免疫电泳。
对流免疫电泳简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高8～16倍（如测AFP敏感度为2.5～5.0μg/ml），但分辨力低于双向琼脂扩散。
注意事项
本方法以高电渗为其特点之一，但电渗作用过强会使多数蛋白质向阴极移动，因此不宜使用电渗作用过强的琼脂。如果抗原也是免疫球蛋白，或抗原抗体的扩散率比较接近，会导致电泳时抗原和抗体向一个方向移动，不能形成对流效应，这种情况下不宜做对流免疫电泳。
