蛋白质纯化策略与考虑因素
纯化策略及影响因素
今天分享一些有关蛋白纯化过程中应该考虑的一些因素。
1、在进行一个蛋白纯化之前，应该对其蛋白有所研究，包括其性质，敏感性，例如该蛋白的溶解性，对高盐或pH敏感，是否容易氧化等；
2、需要考虑蛋白质的用途，来决定制备蛋白的量级规模，这就要考虑到层析柱的尺寸，得到的蛋白浓度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；
3、蛋白质的检测方法，对于含有不同组分的蛋白溶液，其检测方法通常不同，结合其灵敏度，精密性，准确性等综合考虑在不同纯化步骤中选用不同的检测方法；
4、蛋白质缓冲液添加物，出于提高蛋白质稳定性，防止微生物生长，降低冰点或保持蛋白活性等，通常可以添加各种表面活性剂，金属螯合剂，蛋白酶抑制剂，防腐剂，还原剂各种缓存成分等；
5、蛋白的储存条件，保证活性的前提下，其最适的温度，是否可以冰冻，反复冻融，储存容器等；
纯化前需要对序列信息进行研究，可以通过软件分析间接获取一些蛋白的基本情况属性。在表达过程中，选用细菌，真菌，还是动物细胞系统更好，表达后是否保证其正确的翻译修饰，克隆时选择何种标签更易过表达和纯化都是需要考虑的问题。表达后提取物选用怎样的过程进行细胞破碎，破碎过程中是否会引起蛋白变性，结构发生改变，是否会导致降解，稳定性发生变化等。纯化过程中选用何种纯化方式，如盐析，有机溶剂沉淀，还是离心，电泳，层析柱等方法的选择，通过粗提取，到精纯，期间的纯化顺序直至最后的大规模批量化获得。
生物信息学在蛋白质纯化设计中的应用
通常可以得到以下信息：
1、多肽链的分子质量。
2、等电点PI，可以进行离子交换层析或者等电点沉淀方法进行纯化，酸性蛋白质采用阴离子交换树脂，碱性蛋白质采用阳离子交换树脂，
3、摩尔消光系数，色氨酸，酪氨酸，二硫键等在280nm波长处有吸收值，通过摩尔消光系数可以计算蛋白质浓度。
4、半胱氨酸含量，决定是否在纯化过程中添加DTT等还原剂。
5、二级结构，可以判断倾向于形成α螺旋和β转角等二级结构。
6、稳定性，可以预测蛋白质在体内的半衰期和不稳定性。
7、疏水区和跨膜区，可以用来找到潜在的跨膜区域，并且对功能未知的蛋白质，可以预测其是否为膜蛋白。
8、序列相似性暗示同源性和可能相同的辅因子亲和性。可以检索蛋白质数据库以确定其是否与其他某个已知蛋白质具有很高的相似性。9、潜在修饰位点。可以判断是否有糖基化位点，生物素化位点，金属结合位点。
10、大肠杆菌中过表达蛋白质的可溶性。一个蛋白质在大肠杆菌过表达，可以通过序列预测是可溶的还是不可溶的包涵体。
但是通过蛋白质序列仍然无法得到更多精准的信息，例如蛋白质的三级结构，形状，表面属性，多亚基特征，同源多聚体或异源多聚体，沉降属性等。因此通过蛋白质序列可以初步判断一些纯化策略，但更多时候蛋白纯化还是经验性的实验工作为主。
