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蛋白质纯化武器——工艺篇（二）

2021.5.22

（2）包涵体溶解
看了包涵体洗涤部分，怎么溶解包涵体应该心中有数了。无非就是pH，变性剂，还原剂，表面活性剂等等的组合。经典的包涵体溶解液的配方为：pH8.0，20mM Tris，8M Urea。说它经典，是因为我用的最多，嘻嘻。再根据个性蛋白纯化的需要往这个配方里面加调料，如Ni柱纯化的咪唑、氯化钠；溶解或吸附不好时再加点DTT、Triton。

包涵体的溶解也有两个小Trick，独门秘籍哦。第一，包涵体沉淀在溶解时往往会有一些像硬胶状的块块，有弹性，很难溶。你可以在加变性剂之前，加一点buffer进去，用玻璃棒或硬塑料棒搅成面糊糊，尽量不要有大块块。然后再加变性剂磁力搅拌溶解，要溶解迅速得多哦。第二，可以借助超声来溶解。像超声破菌一样操作，超声次数30-50次。超声不仅仅是有利于包涵体溶解，还有一个功效就是打断核酸，降低粘度。这对离心和过滤很重要，很重要。我们在溶解包涵体后往往离心倾倒上清时，溶液很粘，一不小心底部的沉淀就跟出来了；还有过滤时滤不动。这都是没有超声的原因。
六、纯化方法
领袖说过：不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫。对纯化来讲，能拿到纯度好的蛋白，符合你纯化的要求就是硬道理。纯化方法不好讲，各种蛋白不一样，纯化工艺自然不同；即使相同的原料也有不同的纯化方案。纯化的方法我们有层析、沉淀、萃取、透析、超滤等等。

柱层析是纯化最强有力的手段，几乎每种蛋白的纯化都会用到层析。各种层析方法：如亲和、离子交换、疏水、反相、分子筛等等都是我们工艺宝库里的吃饭家伙。不知道怎么吃啊，没办法了，你还是先去补一补基础知识吧。GE公司的一套书个人认为是最佳的入门资料，如Recombinant Protein Purification，Affinity Chromatography，Ion-Exchange chromatography，Gel Filtration，等等，在GE的网站上应该能下载到，或者干脆打个电话给GE的销售员或技术支持，请他给你一个光盘就什么都有了。

在做纯化之前，我们需要知道一些待纯化蛋白的信息。如蛋白质序列，载体类型，理论等电点，理论分子量，疏水性等等，这些都是computer paper work，电脑上查查就有了。如果还能查到一些与目标蛋白纯化相关的文献也不错，不过没有也没关系。我是较少查文献的，奉行的原则是：与其看不如自己做，看了也难以做出来，做不出来了再去看。我就是一个工匠，操作工，而不是做科学的哦。这也是我对纯化的看法，好听一点的就是实践的科学，哈哈。

查文献的目的不在于copy它的纯化工艺，这是新手最最常犯的毛病，以为copy文献就能完成纯化工艺了。要知道文献的真实性是有一点折扣的，作者的原料和纯化的目的与你也不相同。查文献的主要目的在于了解你要纯化的蛋白的性质，它的一些检测方法，特别是有关于活性的检测方法。

怎么讲这一节呢？各种纯化的原理我就不讲了，也不可能有瑞典老兄书上讲得好（GE层析的根在瑞典的uppsala），还是举例来说明吧，做一些简单的分析。讲两个实例，一个是可溶表达的蛋白，一个是不可溶表达的蛋白。
（一）、可溶表达的蛋白A
1、computer paper work：
大肠杆菌BL21，pET32a载体融合表达，N端融合Trx（硫氧还蛋白109aa）和his6-tag（共49aa），DDDDK肠激酶位点后为需要的目标蛋白A，融合蛋白的分子量为21.2kd，Trx（DDDDK前）的分子量为17.1kd，蛋白A的分子量为4.1kd，蛋白A稳定性好，水溶性好，融合蛋白的理论等电点为5.9，Trx（DDDDK前158aa）的理论等电点为5.4，蛋白A的理论等电点为9.7。
2、纯化要求
符合重组药用蛋白要求，SDS-PAGE纯度大于95%，HPLC纯度大于95%，Western Blott单一条带，去除内毒素。
3、纯化设计分析
此为一典型的小分子蛋白融合表达实例。
由于有his6-tag融合可溶表达，可以采用Ni柱来进行初步纯化。
融合蛋白的理论等电点为5.9，可以考虑用Q柱、DEAE柱来吸附纯化。
融合蛋白需要酶切去除融合片断，要做肠激酶酶切工艺。
蛋白A的理论等电点为9.7，可以考虑用SP柱来吸附纯化。
酶切后的蛋白纯化可利用his-tag和pI的差异。
目标蛋白的分子量较小，有可能试一试反相纯化。
纯化样品要求去除内毒素，可以用Q柱、DEAE柱来吸附内毒素。
4、纯化流程
（1）破菌离心：
采用pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl缓冲液超声破菌，离心上清过滤后，量体积，加咪唑至55mM，调节pH为8.0。
点评：破菌缓冲液先不加咪唑，是为了更精确的保证咪唑的浓度，因为破菌过程中，菌体内液体的释放会稀释咪唑浓度。

同理，上柱前的样品要调节pH，因为破菌会使样品的pH下降，细心的话，检测一下，可见pH会从8.0下降到7.7-7.8左右。
55mM咪唑浓度是经过了分段洗脱优化的结果，最大程度地保证目标蛋白吸附，而杂蛋白穿透。做优化时，起始的咪唑浓度一般选择10-20mM咪唑，5-10mM分段加上去。
（2）Chelating Sepharose FF柱纯化：
pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl，55mM咪唑缓冲液平衡后上样；相同缓冲液淋洗完全至基线；150mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱融合蛋白；250mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱杂蛋白。

点评：Chelating Sepharose FF填料是Ni-IDA类型的介质，最大的好处就是可以反复再生使用，特别是脱镍后用NaOH洗柱可以有效地去除内毒素，彻底将填料清洗干净。

150mM咪唑洗脱融合蛋白也是前期分段洗脱优化的结果，综合考虑了纯度和收率以及收样体积的因素。更低的咪唑浓度，如100-120mM咪唑也可将融合蛋白洗脱下来，但是洗脱峰很拖尾，纯度虽然好一些，可收样体积要大许多，收率也略低。

250mM咪唑洗脱杂蛋白不是此工艺中的要点。实际上，我们在操作过程中往往没有此步骤，就直接用EDTA将柱脱镍再生了。
镍柱在上样后的缓冲液淋洗阶段，峰往往很拖尾，要耐得住性子，让它淋洗完全。
此柱的融合蛋白载量大约为20mg/ml。不同的镍柱，不同的蛋白，载量也是不同的。
经过一步Chelating Sepharose FF纯化，融合蛋白的SDS-PAGE纯度大约为90%。
（3）Sephadex G-25（fine）换液
pH8.0，20mM PB做缓冲液置换。更换Chelating柱洗脱融合蛋白的溶液体系，使得适合肠激酶酶切的要求。

点评：Sephadex G-25（fine）的上样量大约为柱体积的30-35%，有轻微的纯化作用，有时候可以去除一些电泳上看不到的小分子杂质。

在酶切之前，本例也做过Q柱吸附纯化融合蛋白试验，吸附没问题，也能做到进一步的纯化。只是后来在工艺整合过程中发现此步不是必需的，就省略掉了。
（4）肠激酶酶切
酵母表达的重组牛肠激酶，酶切用量每16mg融合蛋白用肠激酶1个单位，酶切体系为pH8.0，20mM PB，酶切温度35-37℃，酶切时间16小时。

点评：商品化的肠激酶有多种，有生化提取的，有重组大肠杆菌的，还有就是重组酵母表达的，其中以重组酵母表达的肠激酶活性最高。

此处的肠激酶活性单位为Invitrogen公司产品标准，定义可以参考Invitrogen公司的EKMax manual，不过Invitrogen公司的推荐参考量太低了，它的标准是1个单位20ug融合蛋白，哈哈。

Invitrogen公司的标准酶切体系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, and 0.1% Tween-20。本例中没有加CaCl2和Tween-20，试验表明无明显影响。如果你的融合蛋白不好切，可以考虑增加这两项。

此处的酶切用量标准由酶切梯度试验获得。即固定融合蛋白量，加入不同单位的肠激酶，SDS-PAGE比较酶切效果。取融合蛋白酶切约80-90%的量。可能有人会问，为什么不是95-100%？做过酶切梯度的就会知道，这个10%量的增加是以酶量成几倍增加才能实现，而且酶量越大，非特异性切割的可能性就越大。

酶切时间取16小时是因为下班前加好酶，第二天上班时正好是16个小时，符合我等工作节奏哦。
酶切可置于恒温摇床上进行，转速开得缓慢点。小量酶切就放在恒温培养箱中。
（5）Q Sepharose FF柱纯化
pH8.0，20mM PB平衡Q柱，上样酶切后样品，目标蛋白穿透，未酶切的融合蛋白和Trx-histag吸附于柱上。
点评：此步纯化很简单，仅仅是个流穿纯化，但效果非常好。Q柱不仅去除了绝大部分的杂蛋白，而且还去除了内毒素和酶切时加入的肠激酶。
Q柱在平衡前要用0.5N的NaOH洗柱以去除内毒素，平衡缓冲液要用注射用水配制且通过3kd的超滤膜来去除缓冲液中的内毒素。
样品在上Q柱前，要进行过滤操作。酶切过程中会有少量的沉淀产生，可能是因为我没有往酶切体系中加0.1% Tween-20。药用蛋白不敢随便加表面活性剂，否则要在QC中验证工艺可以完全去除。酶切加入的肠激酶就必须做去除的QC验证，这是后话了。
Q/DEAE类型的阴离子交换柱是纯化中应用最广泛的操作。因为大部分蛋白质的等电点在中性或偏酸性，阴离子交换柱可以吸附纯化。换而言之，如果你的目标蛋白等电点比较高，那么恭喜你了，纯化要方便多了。还不明白？你的目标蛋白与众不同啊，就像本例中的蛋白A，用Q柱可以高效的穿透纯化。
酶切后经过Q柱纯化，蛋白A的SDS-PAGE纯度可以达到95%以上，基本上看不到明显的杂带。但做反相HPLC检测，纯度只有85%左右。由于两种检测方法的原理不同，样品中可能含有一些小分子的杂质，电泳检测不到，而反相HPLC可以检出。还有一个可能，就是酶切毕竟是个蛋白酶的水解过程，特异性再好也有错切的时候。也许有少量的蛋白A被多降解了几个氨基酸。另外就是目标蛋白质本身可能有高级结构方面的差异。回想起来，那可是一段沮丧的日子。***尚未成功，同志仍需努力。
（6）SP Sepharose FF柱纯化
pH5.8，20mM PB平衡SP柱，Q柱穿透样小心调节pH5.8后上样SP柱，目标蛋白吸附于柱上。 pH5.8，20mM PB，90mM NaCl洗脱杂蛋白峰。然后从90mM—300mM NaCl做线性梯度洗脱。分段收集洗脱峰，HPLC检测。
点评：此步SP柱纯化是关键性步骤，使得目标蛋白从SDS-PAGE纯度95%上升到HPLC纯度大于95%。

一般对离子交换层析来说，与等电点相差2个pH单位就可以有效吸附。此步的缓冲体系pH为5.8，这个差值达到了4，比较特殊。确定此pH值经过了多次的小试研究，高点的pH蛋白A都难以吸附完全，也不利于梯度洗脱分离，这点当时很难理解。后来在研究蛋白A的理论滴定曲线时，终于找到了理论依据。原来蛋白A的理论等电点虽然为9.7，但在滴定曲线上，从9.7到6.5的很长一段曲线都是平缓的。也就是说从pH9.7到pH6.5，蛋白A所带的净正电荷都很少，只有0—1个单位左右。当pH为5.8时，蛋白A的净正电荷达到3个单位，这时才能有效吸附。通过本例也可以发现，决定蛋白吸附的不是等电点的差异多少，而是所带净电荷的多少。可能一个蛋白质x比蛋白质y的pI高，但在某个pH时，蛋白y可以吸附阳离子柱，而蛋白x却吸附不好。所以，在理论上，做纯化要善用滴定曲线的差异，特别是小分子的蛋白质，它们普遍有着净电荷与pH不敏感的现象。

90mM NaCl洗脱杂蛋白峰和后面的线性梯度洗脱都是多次小试试验优化的结果。细心点的战友可能会发现，此步中，样品在上柱前调节完pH后并没有经过换液或透析操作，就直接上样了。样品的pH从8.0调节到5.8，体系的电导值会增加很多。大约会从2ms/cn上升到8ms/cn左右。通常这种样品是不能直接上样离子交换柱的。但本例的蛋白A在pH5.8时吸附SP柱很好，90mM NaCl不会洗脱下，所以可以直接上样。在做工艺优化时，也是有意识的想省略掉换液操作这一步，而将体系的pH适当降低了，实际在做实验时，pH6.2条件蛋白A也可以吸附SP柱，但样品的电导值必须降低，也就是要做换液操作或大量稀释。

线性梯度洗脱，分段收集洗脱峰是本工艺中的一个弱点。蛋白A的总纯化收率主要损失在这一步。做过不少试验，想把梯度洗脱改成分段洗脱方式，均未获得成功。可能是杂质与目标蛋白的差异很小吧，分段洗脱对收率的影响更大。好在本例的蛋白表达量很高，而且作为药用蛋白的使用量很低，所以纯化收率的多少对生产的总成本影响不大，它的生产成本主要在冻干和包装上。
至此，蛋白A的纯化工艺全部完成。