贫血患者外周血液标本实验诊断思路实验指导
一、红细胞检查
㈠ 红细胞计数（目视计数法）
【要求】熟悉血细胞计数方法，掌握红细胞计数参考值及临床意义。
【原理】 用红细胞稀释液将定量血液稀释一定倍数，置于血细胞计数板内，于显微镜下计数一定容积内的红细胞数，然后再计算出每升血液内的红细胞数。
【试剂】
红细胞稀释液 [赫姆（Hayem）稀释液]
氯化钠1.0g 硫酸钠（Na2 SO4·10H2O） 5.0g （或无水硫酸钠2.5g）
氯化高汞0.5g 蒸馏水加至200.0ml，过滤后备用。
【器材与仪器】
1．试管、玻棒、2ml玻璃吸管、显微镜。
2．一次性微量吸管：上有10μｌ及20μｌ的刻度线。
3．血细胞计数板：血细胞计数板中央有两个刻度平台（即血细胞计数池），每个平台划分为9个大方格，每个大方格长宽各为1mm，其面积为1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm，故每一大方格的容积为0.1mm3(0.1μｌ)。四角的四个大方格等分为16个中方格，作为白细胞计数用(见图1)； 中央一大方格用双线等分为25个中方格，每个中方格又等分为16个小方格，作为红细胞和血小板计数之用(见图1-2)。
【操作】
1．取试管一支，准确加入红细胞稀释液2ml。
2．消毒皮肤，用采血针刺破皮肤，使血液自动流出，拭去第一滴血，用一次性微量吸管准确取血10μl。
3．擦去管尖外面多余的血液，将吸管插入稀释液底部，轻轻将血全部排出，然后吸取其上清液清洗吸管内残余血液2～3次。
4．混匀后用玻棒沾取红细胞悬液，充入血细胞计数池内，注意充池的液量要适宜，使之恰好充满，无气泡及多余液体溢出。静置2～3min，待红细胞下沉后进行计数。
5．将血细胞计数板置于显微镜下，用低倍镜观察计数池内红细胞分布状况是否均匀，如红细胞分布均匀，即可用高倍镜进行计数。计数中央大方格中的四个角上和中心的中方格（共5个中方格）的红细胞。为准确计数，对于压在线上的细胞计数可采用压在相邻的两侧线者计入（如左侧及上侧），压在另相邻的两侧（如右侧及下侧）线者不计数的原则进行计数(即数上不数下，数左不数右)。
6．计算：将5个中方格所得的红细胞数的总和(N)乘以10,000即为每微升(μl)血液内的红细胞数，再乘106换算为每升（L）血液内的红细胞数。
7．计数完毕后,用清水将计数盘和盖玻片冲洗干净，待干后备用。
【注意事项】
1．显微镜物镜接近计数板时应注意，勿损坏计数板及镜头。
2．计数时进入显微镜的光线要适中，否则不易找到方格。计数池内的细胞分布要均匀，各中方格的细胞相差不应超过±10%，否则重新计数。
3．计数不准确的常见原因：
（1）采血不符合要求，如局部皮肤水肿、炎症、穿刺过浅、过度挤压等。
（2）稀释液量不准，特别在夏季，稀释液放置过久，水份蒸发。
（3）操作太慢，血液凝固。
（4）如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应先做红细胞计数。
（5）红细胞悬液混匀不充分。
（6）计数池充池不均匀，或充满后移动盖玻片。
（7）计数时对压在线上的红细胞，未按压线红细胞计数原则进行计数，造成遗漏或重复。
(8) 当白细胞极度增多时，将使红细胞计数结果假性偏高，故应对红细胞计数结果进行校正。校正方法：校正后红细胞计数结果＝校正前红细胞计数结果-白细胞计数结果
【参考值】 成年男性（4.0～5.5）×1012/L
成年女性（3.5～5.0）×1012/L
新生儿 （6.0～7.0）×1012/L
【临床意义】
1.红细胞的增多
（1）相对性增多 如剧烈呕吐、严重腹泻、大面积烧伤、大汗、多尿等，使体内水分丧失过多，导致血液浓缩。
（2）绝对性增多 多由于缺氧而致红细胞代偿增多，红细胞增多的程度与缺氧程度成正比。少数病例是由造血系统疾病所致。
1)生理性增多： 胎儿、新生儿、高原居民。当剧烈的体力劳动和体育活动后、情绪激动时，红细胞也可一时性增多。
2)病理性增多： 见于慢性心肺功能不全疾患如肺气肿、肺原性心脏病及某些紫绀型先天性心脏病等。此外真性红细胞增多症时，红细胞增多可达（7.0～10.0）×1012/L。
2．红细胞的减少
（1）生理性减少 见于妊娠中、晚期和肝硬化时，血容量增加血液稀释，红细胞相对减少。
（2）病理性减少 是指血中红细胞绝对数量减少。见于造血功能障碍、造血原料供应不足，红细胞丢失和破坏过多等原因引起的各种贫血。
㈡ 血红蛋白测定（氰化高铁血红蛋白测定法）
【要求】 熟悉氰化高铁血红蛋白测定方法，掌握血红蛋白测定的参考值和临床意义。
【原理】 高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白。后者再与氰离子结合，形成稳定的氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）。氰化高铁血红蛋白的最大吸收峰在波长540nm，可用标准的高精度的分光光度计定量测定，其吸光度与血红蛋白浓度成比例。
【试剂】
氰化高铁血红蛋白(HiCN)转化液：
氰化钾（KCN） 0.05g , 高铁氰化钾[K3Fe(CN)6] 0.20g,
非离子表面活性剂(Triton X-100)0.5～1.0ml , 无水磷酸二氢钾(KH2PO4)0.14g
蒸馏水加至1000ml,纠正PH至7.0～7.4。
血红蛋白转化液均为淡黄色透明溶液，配成后用滤纸过滤，置棕色瓶中，在室温中可保存数月，在冰箱中稳定时间更长，但勿使结冰。该液以H2O为空白，于540nm测其吸光度应＜0.001。
【器材与仪器】试管、刻度吸管、微量吸管、分光光度计。
【操作】
1．血红蛋白转化：取HiCN转化液5ml，用微量吸管取末梢血20μl，加入HiCN转化液中，充分混匀，静置5min，使充分反应。
2．比色：用分光光度计比色，波长540nm，光径1.0cm，以转化液或蒸馏水为空白，测定样本吸光度（A）。
3．如果使用符合WHO标准的分光光度计，可根据样本吸光度（A）直接计算血红蛋白浓度。
4．当使用的分光光度计不符合WHO标准时，可先使用已知浓度的血红蛋白标准液制作HiCN的标准曲线，然后根据样本吸光度在标准曲线上查取血红蛋白浓度。
【注意事项】
1．使用光电比色计之前须校正仪器。
2．采血用的血红蛋白吸管20μl的准确性应在±1%以内，5.0ml移液管的准确性在± 0.5%以内。当使用标准曲线时，应定期对标准曲线进行校正。
3．样品在读数前应清晰，如发生混浊，可能有以下几种情况：
（1）血中白细胞过多，可离心后取上清比色。
（2）血中有异常球蛋白，可在溶液中加0.1g碳酸钾。
（3）有硫化血红蛋白或血红蛋白C时，则可用蒸馏水按1∶1稀释，结果乘以2即可。
（4）氰化试剂是剧毒品，在配试剂时要严格按剧毒品操作。如发现变绿、变混则不能使用，pH低于7.0时应进行调整。
4．血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中，否则CN-浓度下降，致使结果偏低。
【参考值】
成年男性 120～160g/L
