转基因作物田间试验的设计与管理实验
实验材料:转基因株系
实验步骤：
3.1 释放试验的地理位置要求
释放地点应是宜于种植该作物的一个隔离区，其动植物区系与周围农田没有差别，而且没有稀有或受保护的植物或动物物种，也必须确保释放地点较远的区域没有政府机构认定的群落生境或保护区。试验区要求地势平坦，既要能减少基因逃逸的危险，又要便于耕作，使试验尽可能地精确，尽量减小试验误差。
3.2 试验管理的说明
3.2.1 试验田的准备
试验区根据所栽培作物的常规操作准备试验田，精心挑选能够及时收获并无前茬残留物的田块，以确保苗床优质，因为残留在土表的秸秆和根须很容易缠绕在小区播种机的犁刀上，使小区试验难以实现精确。小面积的转基因试验不应该在以前做常规试验的小区试验田上进行。
3.2.2 施肥
肥料应按常规耕种和生产要求施用。化肥用量多少需考虑转基因植株的株高，由于高秆的转基因植株容易倒伏，氮肥的施用量应比正常的用量略少。小面积田间试验不应施用有机肥，以免造成土壤养分的不均匀。
3.2.3 土壤消毒
这项措施仅限于可能有病虫草害危害时，并且只有当这种处理不会对试验目的有影响时才能使用。
3.2.4 试验的设计与准备
开展试验的第一步是制订试验方案，确定待测试的基因型及其在试验设计中的布局，设定试验区的大小、重复的次数和试验方案等。按播种清单准备试验种子，清单包括详细的试验代码、每个区的编码和种子的来源（哪个试验的哪一个试验区）。此外，品种名称和基因型的谱系，或其他标识性数据通常也要包括在内。对于某些类型的试验，播种清单还要标注每个小区播种的行数和播种的种子数量。
3.2.5 种子准备
如何准备试验种子，取决于转基因的世代高低；也取决于测试的基因型是直接转化获得的，还是用转基因材料培育的；以及所能提供的种子数量多少等因素。上一世代入选的穗子，用单穗脱粒机脱粒，也可以人工脱粒，要将脱粒的种子存放于专门的容器。所有的种子按播种清单依次排序。如果有必要，还要对种子进行清选，清选时应选用可避免不同基因型混杂的实验用种子清选机。如果有需要也可以对种子进行包衣，并按每个小区的播种数量分装入小袋子。播种前，准备好的种子应与其他试验材料分开单独保存。当脱粒、清选、包衣和计数完成后，实验设施和房间需要彻底地清洗，任何多余的种子和其他的植物组织要收集好并销毁。
3.2.6 播种
如果只有少量的种子，T1 代 和 F1 代，可用手工宽距播种，也可用单粒种子播种机播种。对高世代的种子，如 T2、Tn
或回交转育的分离群体，单穗脱粒的种子在下一代单独播种成穗行。单粒传（SSD)
方法很少用于田间试验的加代。转基因纯合的群体，常用一种特制的试验用小区播种机或穗行播种机播种成小小区。这些机器设计独特，能把手动或自动装入的所有种子在设定的距离内全部播种完。播种的密度可以通过改变种子的数量或播种距离来调整。这样，田间连续播种的种子不会混杂，播种后机器也不需要清洗。播种机在播种后会进行覆土和压土等，这样播种后不必再一次耕作。
3.2.7 转基因田间试验的隔离
转基因植株四周至少应该种植 2 m 宽的常规小麦品种，且有至少 20 m 宽的空闲农田或非禾谷类作物区。待试验中最迟的材料开花后，转基因小麦与常规小麦再也没有相互杂交的风险时，这 2 m 宽的保护行小麦植株可以销毁。
3.2.8 传病的边行
如果田间试验目的是为了鉴定转基因系对真菌的抗病性，为了便于人工接种的诱发，边行必须种植由感病基因型组成的材料。在鉴定小种专化型病害或虫害的试验中，边行要混合种植多种基因型的材料。用实验室培养的菌种直接接种转基因植株是鉴定抗性的另一种方法
[ 3 ]，这一方法需对转基因的部分植株或每一小区的一行进行接种。
3.2.9 杂草控制与病虫害的防治
当作物出苗后，要对小区两端边界的苗进行修整，以形成最终小区的大小。这项操作可以用手工完成，也可以用旋耕机修整，或者喷施广谱除草剂。每个小区用塑料标签标示，标签用热敏打印机打印并固定在标牌杆上。标签上需包含本小区的识别信息或其他相关信息，标签内容既要肉眼可辨，又能被条码机识别。当同时收获许多小区时，小区的标签可取下粘贴在包装种子的纸袋或布袋上，确保在整个试验过程中小区的编号不会搞错。如果试验地气候适宜的话，建议播种后立即喷施苗前除草剂，对其极易发生草害的稀播小区尤为重要。对于禾本科杂草和阔叶杂草，采用常用的控草措施，并充分关注当地杂草群落中的优势草种。如果试验没有特别要求，允许使用杀菌剂和杀虫剂进行病虫害的防治。在成熟前，用网遮盖小区，以防鸟类传播种子。
3.2.10 灌水
通常小麦不需要浇水。唯一的例外是，为了保证转基因植株在干旱条件下能存活，才进行浇水。在检定转基因植株的抗病性时，也可能需要对试验田进行浇水以促进发病。对某些人工接种试验，如接种小麦赤霉病菌（FManum
)，也可以利用浇水来保证田间高湿环境。在测试干旱和高温逆境效应时，也需要对浇水与非浇水进行对比试验。
3.2.11 考察与记载
根据试验设计编排田间记载本，用于记录田间采集的数据。记载本除了记载本次试验的样本编号等信息外，还应该包括以前相关试验中所有的观察记录和措施。按照试验方案，在整个生长季节定期考察各试验点，记录表型数据，并与非转基因的标准值进行比较。观察转基因小麦对生物逆境抗性的表现型反应，一旦观测到感染，应该立即记载。
3.2.12 收获
根据试验的需要，或者选用小区试验收割机收获整个小区，或者对转基因株系进行单穗选择。收获的籽粒装入纸袋或布袋，并贴上相应的标签确保种子和编号准确无误。用于标识小区的标签，也可用作收获时的种子标签。装有种子的纸袋或布袋，应放入封盖的盒子或容器中，以防种子在路途中撒落。转基因小麦应该与非转基因的材料分开单独储藏，并清晰地一一标注。繁殖获得的数量和已使用种子的数量都要准确记录。为防止机械混杂，在离开试验区前，应对收割机进行彻底地清理，确保没有任何种子或穗子残留在收割台、滚筒和滤筛上。散落的种子在土壤中自然发芽可能是转基因小麦与常规小麦间产生机械混杂的一个原因，因此，应在收获中尽量减少撒落，努力确保麦穗不要遗留于田间。
3.2.13 收获后处理
遗落田间的残留植物材料必须取走或耕入土壤中。通过观察遗落种子的发芽情况来决定翻地和耕种的时间。对遗落而萌发的种子，采用喷洒相应的除草剂或者通过翻耕来去除。下一年，这块地不能再种植农作物，第三年可种植非禾谷类农作物，或者让土地闲置。
3.2.14 应急措施
在试验中，万一发生最不愿意看到的意外，或者植株发生扩散等事故时，必须立即去除或销毁所有的植株材料，任何遗留的材料都要耕入土壤中。如果有必要的话，还要对小区和小区周围 2 m 左右的区域喷施相应的除草剂。同时，必须对该区域的复种情况进行监测。
3.3 作物田间试验的环境风险评估
风险评估是转基因作物田间试验管理的重要组成部分。特别要关注基因转移的风险，一是关注通过花粉进入其他作物，或者从植物进入土壤的细菌中；二是关注目的基因或标记基因对其他生物体的影响。因为小麦是自花授粉作物，所以基因转移的概率似乎并不大。同样，至今没有因导入序列的产物而发生负面影响的报道。不过，仍需要评估发生有害影响的潜在概率，时刻关注周围的环境状况。
3.3.1 存活、扩散和传播的能力
小麦是一年生植物，所以它只能通过生产籽粒而延续后代。春小麦通常是
3 月播种，7 月或 8 月收获；而冬小麦播种期因地区而异，常在 9 月至 11 月下旬播种，成熟期一般比春小麦早 10~15
天。提早收获能尽量减少因动物或鸟类叼食种子或麦穗而传播材料。可是，成熟的麦粒在收获前或收获期间会掉落到地面，其可能捱过冬天，在来年春天发芽生长。收获后要烧毁秸秆，田间的任何植物残留物需翻耕入土。转基因编码的蛋白质及其作用产生的新组分，在土壤微生物的代谢作用下会被迅速降解。
收获后，掉落的籽粒在割除麦茬后会露出来，可以通过再一次的耕种作业将这些籽粒翻入土壤中，使它们不能长期地存活。通过对田块喷施除草剂、去除所有任何再生苗等处理，可以将遗留籽粒存活的概率降到最低。建议在收获和去除植物残留物后的
10 天内，对环境释放试验地喷施浓度为 3 L/hm2 草甘膦除草剂。如果有必要的话，可以喷施两次除草剂。下一年，对试验区定期监测，如果发现有任何发芽的小麦，必须手工拔除并烧毁。土壤的温度也会影响籽粒的存活能力。例如，对春小麦而言，冬季的霜冻会极大地降低遗留籽粒的存活能力。
3.3.2 基因通过花粉转入其他小麦植株的可能性
在自然条件下小麦的自花授粉超过
99%，所以转基因株系与其他小麦品种发生天然杂交的概率非常小。小麦的花粉粒比较重，正常情况下被风刮起后，它们存活的距离不会超过 5~10
m，存活时间也只有 1~3 min，所以，只有在极端天气条件下才会发生异交授粉，且最多在 10~20 m 的距离之内。
3.3.3 基因通过花粉转入其他物种的可能
有人担心转化的作物可能成为无法控制的杂草，转移的基因还将扩散到杂草等类似的野生物种中，从而形成极其顽固的杂草，即所谓的
“超级杂草”。尽管大多数作物在多数的种植区域并没有发生与近缘种杂交产生后代，但是一直有人因为导入的基因有可能传播到杂草上，因而建议禁止所有的转基因作物。
若小麦与相关的野生种，如山羊草、冰草、黑麦草、大麦、披碱草同时开花，发生天然杂交的概率也非常小
( 大约 1% )
。至今，还没有任何报道发现小麦与野生种天然产生的杂交植株，而且如果可能有任何这种杂交后代的话，它们要么是不育的，要么存活力非常低。确保实验区
50 m 内没有与栽培品种相关的植物，也能最大限度地减少异花授粉的可能性。尤其是能与小麦杂交的栽培黑麦，不得在试验地点的附近区域种植。
3.3.4 基因转入微生物或动物的可能
在自然条件下，基因水平地从植物转移到土壤细菌或肠道细菌中的风险是非常低的。与细菌中基因发生自然突变相比，如自发产生氨苄青霉素的抗性突变，基因转移对人类健康的风险是微乎其微的。编码
β- 葡萄糖苷酸酶（GUS)
的以必基因常常被用作遗传转化的标记基因，该基因也广泛存在于微生物中。用于转化试验的质粒载体，往往携有氨苄青霉素抗性基因，由于该抗性基因受原核生物的启动子调控，在转基因植株中不能表达，且这种基因也存在于土壤细菌中。万一有氨苄青霉素抗性基因水平转入土壤细菌中这种极端事件发生，被转化的土壤细菌只有在添加相应的抗生素的土壌环境中才具有选择优势。
3.3.5 导入序列表达产物的影响
必须关注目的基因产物可能导致的风险，但是，基因转移最大的风险还是来自于选择性标记基因的产物。抗除草剂或抗生素等选择性标记基因并不是转基因植株所需要的基因，因此，目前研究的重点是研发新技术，去除转基因植株中的选择性标记基因。通过常规的基因分离方法，可以实现去除选择性标记基因
[ 9 ] ，但是，人们更看好同源重组法去除标记基因。多元自主转化（multiauto- transformation, MAT)
载体系统正是应这一目的发展起来的，它只需简单一步就可以获得无标记基因的转基因植株 [ 10 ]
。然而，无论是对小麦还是环境中的其他生物，目前没有报道转基因作物因导入序列而产生潜在的有害产物。
3.3.6 表现型与基因型的稳定性
组织培养和转化试验可能产生与转基因效应无关的表型效应，而且这种表型效应理论上会对田间试验产生影响。因此，田间释放试验的所有转基因株系，都应选用表型上与对照相似的植株，以避免表型效应的影响。
变异也可能由外源基因的不稳定引起，当发现转基因植株出现发育异常时，育种家需要采用与其亲本回交的方法，从而选获表型上与被转化的亲本相似的株系。因此，所有的入选田间试验的株系，应当通过若干世代种植，获得遗传稳定的株系。
3.3.7 对非靶标生物的有害效应
小麦对人类或其他物种通常不是致病源，转化植株的致病性，或其对人类和其他生物的影响，不会与其亲本或对照品种之间有不同表现。过敏人群食用小麦制品可能导致某些不良反应，如过敏反应、面筋的不耐受反应导致的腹腔疾病（
coeliac disease) 和痕疹性皮炎（dermatitis herpetiformis)
等，而面包师哮喘（baker’s asthma)等呼吸过敏可能是由于吸入面粉所引起的。同样，小麦面粉可能导致枯草热过敏 ( hay
fever allergy)
。然而，没有任何证据表明，在转基因小麦中这些有害效应会更加严重。根据我们的经验，转基因小麦的各种有害效应与其对照或非转基因植株的表现是一样的。
