实用哺乳动物细胞培养手册（二）
消化液：
分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠 (EDTA) 两种溶液。可以 单独使用，也可以混合使用。
（1）胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺。胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相 互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰 酶溶液在 pH8.0，温度为 37℃ 时，作用能力最强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无 Ca2+、Mg2+的 D-Hanks』 平衡盐溶液配制成 0.25% 溶液。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对 细胞的消化作用。
胰蛋白酶溶液配制：
（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许 D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状， 然后再补足 D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；
（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度 为 0.25% 或 0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调 pH 至 7.2 左右。
保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20℃ 冰箱中，以免分解失效。
EDTA•4Na 溶液
EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便。 常用工作液浓度为 0.02%。通常与 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 1：1 混合使用（混合液）。
注意：使用 EDTA 处理细胞后，一定要用 Hanks 液冲洗干净，因残留的 EDTA 会影响
细胞生长。
EDTA 溶液配制：用无钙、镁的 D-HBSS 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 室温或 4℃ 冰箱保存。
胰蛋白酶–EDTA•4Na 溶液（0.05% 胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA•4Na）
0.5 g 胰蛋白酶＋0.2 gEDTA•4Na＋1L D-HBSS。-20℃ 冰箱中保存。
pH 调整液
（1）NaHCO3 溶液
常用浓度为 7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4℃ 冰箱或室温保存。 当 pH 值超过后，可用高压灭菌的 10％ 醋酸溶液或通入 CO2 气体方法调节。
（2）HEPES（分子量 238.31）溶液
HEPES 使用终浓度一般为 10-50 mM, 但通常配成 1M 储存液：用 200 ml 双蒸水溶解 47.6 克 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0; 然后过滤除菌，分装小瓶，室温或 4℃ 保存。 抗生素溶液
酚红：
大多数培养液中使用酚红作为 pH 指示剂。红色表示中性 pH，黄色代表酸性 pH，紫色表 示碱性 pH。但是，在一些特殊培养液中不含酚红，因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用。
丙酮酸钠：
是细胞液中细胞的另一种碳源。D-葡萄糖是细胞优选碳源，但是当培养液中 D-葡萄糖耗 尽时，细胞可以代谢丙酮酸钠获取碳源。
抗生素
哺乳动物细胞冷冻保存
主要目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。
（2）减少细胞被微生物污染的危险性。
（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。
（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。
（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。
(6) 降低人力和物力。
冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在 4℃ 冰箱中放置 30－60 分钟；然后转入-20℃，放置 30 分钟；然后再转入-80℃ 放置 16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3℃ 速度降温，一直 到-80℃ 以下，然后直接放入液氮中长期保存。
（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于 90％，无微生物污染。
（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。
（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血 清浓度大于 20％。
（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用 的冷冻保护剂是 DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为 5－10％。但是，有些细胞系不能用 DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系 HL-60。因为，DMSO 能诱导 HL-60 细胞分化。在这种情 况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）, 羟乙基淀粉等。
特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20℃ 冰箱内放置时间不可超过 1 小时，以防止冰 晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃ 这一步骤直接放入-80℃ 冰箱中，但这样做细胞存活率要
低一些。
（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的 DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应 立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃ 保存。避免反复冻融造成 DMSO 裂解产生有 害物质。并可减少污染机会。如要过滤 DMSO，必须选用耐 DMSO 的尼龙滤膜。
细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。
常用细胞冷冻保存液：（1）10％DMSO ＋ 完全细胞生长培养液（20％ 血清＋基础培养液）
（2）10％ 甘油 ＋ 完全细胞生长培养液（20％ 血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：
（1）取对数生长期细胞培养物，离心 200－400 g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：
冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃ 水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在 1 分钟内全部融化（不要超过 3 分钟）。
（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快， 而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1 ml 冻存细胞液加入到 25－30 ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除 DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后 的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。
特别注意：（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入 37℃ 水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。
（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。
解冻冷冻保存细胞的离心方法:
(1) 从液氮中取出冻存的细胞，立即放入 37℃ 水浴中快速解冻。
（2）将 1－2 ml 冻存细胞液加入到 25 ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。
（3）用 80 g 离心 2－3 分钟，弃上清液。
（4）用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。
（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为 3×105/ml。
